Xpert MTB/RIF及Xpert MTB/RIF Ultra在涂阴肺结核中的诊断价值

陈 蕊 朱建波 马 南

1 滨州医学院在职研究生，山东省烟台市 264003； 2 烟台市蓬莱人民医院； 3 滨州医学院附属滨州市人民医院

结核病(TB)是一种由结核分枝杆菌引起的、严重威胁人类健康的重大传染性疾病，是全世界十大死因之一，也是单一传染源的主要死因。世界上大约1/4的人口感染了结核分枝杆菌。在2019年，约有1 000万人患有结核病，140万人死亡。结核病可以在任何地方影响任何人。当结核病患者将细菌排到空气中时(例如咳嗽等)，结核分枝杆菌就会传播。结核病通常会影响肺部(肺结核)，但也会影响其他部位(肺外结核)[1]。WHO期望至2035年的患病率减少90%，死亡率减少95%[2]。因此，早期诊断结核病，减少传染源，预防结核病传播显得尤为重要。

结核病具有发病缓慢隐匿、易于传染等特点，但是常规的影像学检查具有特异性低、与其他肺部疾病难以鉴别的特征，而结核病细菌学的诊断方法中痰涂片的检出率较低(虽操作简单，但结核菌数目需>5 000条/ml才能得到阳性结果)、痰培养耗时长(常用的固体培养通常需要4～8周的时间才能得到结果，且需要专门的实验室和高技能的工作人员)。此外，有学者统计发现我国的结核病传播以近期传播为主，而1/3的近期传播由涂阴培阳结核病患者所致[3]，因此，在取得痰培养结果之前，涂阴肺结核的快速诊断对控制结核病的传播有着重要的意义。

近几年分子检测技术取得了相当程度的进展，WHO分别于2010年、2017年推出Xpert及Xpert Ultra，这对诊断涂阴肺结核、提高病原学阳性率起着重要的作用。

1 结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术的临床应用

1.1 Xpert的检测原理及推广 结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert Mycobacte-riumtuberculosis/Rifamfampin，Xpert MTB/RIF,简称“Xpert”)技术是由美国Cepheid公司开发一种有助于结核病诊断及利福平耐药性的快速分子检测方法，其实现了诊断过程的自动化，操作简便，检测周期短[4]。有研究显示[5-6]，Xpert 技术检测痰标本中MTB仅需要5个纯化的基因片段或131菌落形成单位(cfu)/ml，2h内即可报出结果，并且可以检出利福平耐药基因(ropB突变基因)，即针对rpoB基因81bp利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针，检测其是否发生突变。2010年，世卫组织批准了Xpert MTB/RIF检测法，用于对疑似耐多药结核病或HIV相关结核病患者进行初步诊断检测。2014年，世卫组织将这一建议扩大到所有患者[7]。WHO十分认可Xpert MTB/RIF，并认为这种检测方法可能对结核病的治疗和控制带来革命性变化，是全球结核诊断和治疗方面的一个重要里程碑。Laura Maynard-Smith等[8]于2014年时提出，Xpert对大约2/3的涂片阴性样本具有较高的特异性。Dorman SE等[7]在其研究中也提到，在2013年2月7日之前2 000名受试者中，Xpert对痰涂片镜检阴性的肺结核患者的敏感性为67%。利福平耐药性的表现特征为95%的敏感性和98%的特异性，证明了Xpert在涂阴肺结核患者中,检测是否为结核分枝杆菌感染及对利福平耐药具有较高的效能[9]。

1.2 Xpert的不足之处 作为新型肺结核检测手段，Xpert对肺结核的快速诊断起着日益重要的作用，但随着Xpert的应用更加广泛，同时也发现其有相对不足之处。首先，Xpert同时检测出活的和死的细菌[10]，这导致Xpert不能对治疗后的疗效进行评价，同时对肺结核的复发情况的提示意义也受限。其次，有研究表明Xpert检测野生型与突变型菌株混合标本的利福平耐药相关突变的能力有限[11]。

2 超敏结核分枝杆菌和利福平耐药基因检测技术的推出

2.1 Xpert Ultra的改进原理及临床应用 2017年3月世界卫生组织(WHO)于世界防治结核病日推荐新一代超敏结核分枝杆菌和利福平耐药基因检测技术(Xpert MTB/RIF Ultra，简称“Xpert Ultra”)，可替代目前的Xpert MTB/RIF试剂盒。相较于Xpert，Xpert Ultra试剂盒内的变化包括一个更大的DNA扩增仓室(意味着更大量的标本用于DNA的扩增和检测)和两个额外的分子靶标来检测结核菌(Xpert Ultra整合了两种不同的多拷贝扩增靶点，即IS6110和IS1081[12])。Xpert Ultra在基本不改变Xpert操作步骤的同时，通过改善检测系统，进一步提高检测水平，主要表现在以下几个方面：(1)Xpert Ultra进一步缩短了检测时间：由原来Xpert所需要的110min缩短至66min(报阳时间)、77min(报阴时间)，提高了检测效率；(2)Xpert Ultra增强了检测低数量细菌的能力：最低检出限由Xpert所需的131cfu/ml下降为11.8cfu/ml，从而增加Xpert Ultra检测的敏感性；(3)Xpert Ultra也做出了有关于耐药性的检测方面改善。Xpert Ultra修复了Xpert检测ropB基因突变类型中沉默突变时错误报阳的情况[6]。Xpert Ultra通过重新设计一组ropB基因的稀松分子信标来提高第553 号密码子突变(此密码子与利福平耐药相关)的检测质量，尤其是突变型与野生型DNA混合时。此外，Xpert Ultra还修复了另一个ropB基因的稀松分子信标，从而能够将沉默突变Q513Q和F514F与其他利福平耐药相关的决定区域的突变区分开来。通过以上两种方式，Xpert Ultra改善了对沉默突变菌株的检测水平，提高了利福平耐药检测的准确性[12]。

Dorman SE等[7]于2017年总结世卫组织的结论，Xpert Ultra克服了Xpert检测肺结核的敏感性和检测利福平耐药的准确性，作为Xpert的替代品，可以用于对有结核病症状或体征的成人进行初步检测。并且通过一项包括2 368名参与者的前瞻性多中心研究结果表明，Xpert Ultra对涂片阴性(但培养阳性标本)的敏感性为63%(相同条件下Xpert敏感性为46%)，进一步证实了Xpert Ultra在检测肺结核方面比Xpert更为敏感，尤其是对于贫杆菌标本(即可用检测效果最差的涂片阴性标本)。Chakravorty S等[12]、Opota O等[13]也在其研究中得到相似的结论。同时也提示我们在临床实践中，对于涂阴肺结核等死亡率较高的人群，Xpert-Ultra的高灵敏度有助于对其早期诊断[7]，可以显著减少肺结核(包括利福平耐药的肺结核)等待时间，减少了治疗的延迟(对于耐药结核可以快速启动耐药治疗[14])，减少因延迟诊断治疗导致的死亡。

2.2 Xpert Ultra的缺陷 尽管Xpert Ultra的敏感性较Xpert增加，但是仍不能克服Xpert的某些缺点，最重要的就是仍然不能区分活的和死的杆菌[13]，这使得Xpert Ultra对既往有结核病史的患者诊断提示意义较局限。除此之外，Dorman SE[7]、Horne DJ等[14]均在其文章提到，Xpert Ultra敏感性的提高是以特异性丧失为代价的。Chen X等[15]在统计分析时也总结出类似的结论，Xpert Ultra比Xpert有更好的敏感性和略低的特异性，而且也指出Xpert Ultra的假阳性结果通常出现在以前接受过结核病治疗的成人身上。这与Opota O等[13]的结论相呼应。我们仍需要再进一步的研究，以阐明敏感性增加和特异性降低之间的权衡关系，并确定Xpert Ultra阳性和培养阴性结果的生物学基础[7]。

综上所述，Xpert及Xpert Ultra可以快速、准确地诊断出少菌型肺结核并同时检测其耐药性，这对涂阴肺结核的早期诊治具有重要意义。通过减少患者多次反复检查的时间及花费、减少对痰培养及传统耐药检查的等待时间来缩短诊断的时间，Xpert及Xpert Ultra明显提高了涂阴肺结核的诊治率，为我们完成WHO提出的“终结结核流行、自由健康呼吸”的目标提供了巨大帮助，对减少结核病在社会传播、维护良好的公共卫生环境具有重要意义。尽管Xpert Ultra目前在国内未推广应用，但是鉴于对Xpert在国内外的广泛应用的研究及其对结核诊断带来的便利，Xpert Ultra的推广应用值得期待。