Wnt/β-catenin通路调控子宫内膜异位症、子宫腺肌病上皮间质转化和中药干预策略及机制

凌 静，甄玉花，张明子，杜雪莲

(深圳市中医院，广东 深圳 518033)

子宫内膜异位症(内异症)是指子宫内膜组织(腺体和间质)出现在子宫体以外的部位；子宫腺肌病(亦称子宫腺肌症)是指子宫内膜腺体及间质侵入子宫肌层，其特征是异位的内膜腺体和间质出现在子宫肌层弥漫性生长，并伴随周围纤维组织增生[1]。郎景和院士强调把子宫腺肌病作为内异症的一种表型来对待[2]。无论是内异症亦或子宫腺肌病，均为具有生长功能的子宫内膜异位他处继续生长所致。尽管病因不尽相同，但均受雌激素的调节。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在二者发病过程中均扮演了重要角色。Wnt/β-catenin信号通路是诱导EMT的关键信号通路。本文就Wnt/β-catenin信号通路调控内异症、子宫腺肌病EMT机制及中药干预机制研究进展进行综述。

1 内异症与子宫腺肌病发病相关性

内异症与子宫腺肌病临床上常共存[3]。曾有回顾性研究发现21.8%内异症患者手术过程中发现合并子宫腺肌病[4]。既往曾将子宫腺肌病称为“内在性子宫内膜异位症”，而其他部位的内异症称为“外在性子宫内膜异位症”。虽然内异症与子宫腺肌病临床症状相似，如疼痛和不孕是二者共有的常见症状[5-6]，但是发病机制、危险因素又存在各种差异[7]。由此引发二者是“两种不同的疾病”亦或是“同种疾病的不同表型”一直是学术圈探讨多年的热点。内异症和子宫腺肌病都是古子宫起源疾病[8]。郎景和院士提出“在位内膜决定论”是子宫腺肌病和内异症的共同发病基础，即子宫腺肌病和内异症患者存在结合带异常和异常子宫收缩[9]，深层原因在于子宫内膜异常，包括干细胞、免疫和激素反应异常等[2]。

2 Wnt/β-catenin信号通路与内异症、子宫腺肌病

2.1EMT在内异症、子宫腺肌病发病机制中的作用 “EMT”指固定的具有极性的上皮细胞转化成具有侵袭、转移性的间质细胞，从而促进细胞的侵袭、转移[10]。通过EMT过程获得侵袭及迁移能力的子宫内膜腺上皮细胞是内异症、子宫腺肌病发病的先决条件[11]。EMT过程的标志特征是腺上皮标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin)的降解和间质表型标记物N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达的升高，并伴随细胞迁移和侵袭能力的增强[12]。早在1983年，就有日本学者在动物模型中发现子宫腺肌病的早期征象是子宫内膜间质细胞沿血管分支进入子宫肌层，然后子宫内膜腺上皮细胞沿着子宫内膜间质细胞的路径侵入子宫肌层引起子宫腺肌病[13]。大量研究提示子宫腺肌病病灶、内异症异位内膜组织均存在E-cadherin下降[14-16]，伴随Vimentin升高[17-18]。子宫腺肌病子宫内膜-肌层界面(endometrial myometrial interface，EMI)处腺体细胞E-cadherin表达下调，直接导致子宫内膜细胞之间以及子宫内膜细胞与基质之间的黏附作用降低，从而变得易从在位部位解离，侵入和种植在肌层中[19]。内异症患者异位内膜组织中转录抑制因子Twist蛋白表达与E-cadherin表达呈负相关关系，与N-cadherin表达呈正相关关系[20]。过表达Twist后在位子宫内膜间质细胞N-cadherin上调、E-cadherin下降并伴随着细胞迁移和侵袭能力提高，可能与内异症在位及异位内膜组织Twist基因启动子区域性低甲基化有关[21]。子宫腺肌病的在位内膜、异位内膜中Snail的表达强度上升，并与E-cadherin表达强度成负相关，表明子宫腺肌病的发病原因之一可能是由于转录抑制因子Snail的高表达抑制了E-cadherin的表达，导致内膜细胞间的黏附性下降而异位于子宫肌层[22]。

2.2Wnt/β-catenin通路在内异症、子宫腺肌病EMT发生中的作用 Wnt/β-catenin信号通路在细胞增殖和肿瘤细胞发生中起到重要作用[23]，也是诱导上皮细胞发生EMT的关键因素。β-catenin具备双重生物学功能，一方面定位于胞膜内侧面，与跨膜的E-cadherin介导细胞的黏附，维持细胞形态稳定[24]；另一方面存在于细胞质中，作为经典Wnt/β-catenin信号通路的关键调控分子。当信号通路激活，Wnt与卷曲蛋白(frizzled，Frz)受体及共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor related protein，LRP)结合，Frz作用于细胞质内的蓬乱蛋白(Dishevelled protein，Dsh)使其磷酸化，磷酸化的Dsh引起β-catenin-AXIN-APC-GSK3复合物解体，解体的GSK-3β切断β-catenin的降解途径，致β-catenin磷酸化受阻，在细胞质内积累，进而转移至细胞核内，与T细胞/淋巴增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，Tcf/Lef)相互作用，启动靶基因的表达[25]。

近年研究发现Wnt/β-catenin 信号通路的激活促进了内异症及子宫腺肌病EMT的发生。内异症在位内膜间质细胞β-catenin在内异症在位内膜和异位内膜的表达明显高于正常对照组，其中在位内膜表达最高[26]。β-catenin在子宫腺肌病在位和异位内膜中的表达水平均比正常内膜表达水平高，同时伴随E-cadherin降低，Vimentin升高[27]。内异症患者在位内膜间质细胞β-catenin的表达明显高于非内异症患者，阻断 Wnt/β-catenin信号通路后，其下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)的表达明显受到抑制[28]。亮氨酸拉链转录因子样蛋白(leucine zipper transcription factor like 1 protein,LZTFL1)、β-catenin蛋白在子宫腺肌病异位内膜明显降低。当内膜细胞上LZTFL1蛋白的表达下调，E-cadherin不能正常连接细胞骨架肌动蛋白，介导细胞黏附复合体解体，使胞膜上β-catenin减少，胞浆池β-catenin的水平上升积聚到一定水平，激活Wnt/β-catenin信号通路，具有活性的β-catenin转移进入细胞核内与转录因子Tcf/Lef结合激活靶基因，促使细胞膜表面介导细胞黏附的各种蛋白的表达进一步下调，而使细胞具有活动、迁移能力的相关蛋白表达上调，导致内膜细胞骨架崩解，侵袭能力增强[29]。

2.3雌激素介导Wnt/β-catenin通路调控EMT 内异症和子宫腺肌病都是公认的雌激素依赖性疾病。2010年，台湾学者Chen等[30]研究发现子宫腺肌病患者异位病灶Vimentin的表达明显增高，E-cadherin的表达较在位内膜明显降低，且与局部雌二醇(estradiol，E2)水平负相关，从而提出雌激素诱导EMT发生在子宫腺肌病发病中的重要性。E2作为细胞外信号，需要与其受体(Estrogen receptor，ER)结合后方能发挥进一步生物学作用。子宫腺肌病中的EMT过程具有雌激素依赖性，并与局部E2浓度相关，而ER抑制剂可以消除这一效应[31]。在内异症在位内膜上皮细胞中，过表达ERα上调了EMT水平，而敲除ERα则抑制细胞EMT转化[32]。

与雌激素相关的子宫腺肌病EMT过程与激活的Wnt/β-catenin信号通路关系密切[33]。在子宫内膜腺上皮细胞中，雌激素明显增加去磷酸化β-catenin的表达，能增加β-catenin入核，与Tcf-3结合，作用于Snail启动子上游，正向调控Snail基因的表达[34]。进一步研究发现，雌激素启动Wnt/β-catenin通路活化是通过其受体ERα实现的[35]。Wnt信号通路的关键蛋白β-catenin可与雌激素受体直接通过交叉作用(cross-talk)参与多种生理和病理过程[36]。雌激素通过受体ERα上调β-catenin表达，促进其入核，激活Wnt通路，继而β-catenin与核转录因子Tcf-3/Lef-1结合，启动下游靶基因VEGF、MMP9，促进异位子宫内膜的黏附、侵袭和血管生成[37]。17β-E2处理后的正常子宫内膜间质细胞中β-catenin升高，这一效应可被雌激素受体拮抗剂阻断，沉默表达β-catenin也可拮抗雌激素造成的侵袭能力增加；免疫共沉淀结果表明，ERα和Lef-1/Tcf-3、β-catenin和Lef-1/Tcf-3存在蛋白相互作用，并且雌激素刺激时间越长，ERα和β-catenin蛋白表达也越高，相应的Lef-1、Tcf-3的蛋白也显示有所增高[38]。

3 中药有效调控Wnt/β-catenin通路介导EMT是治疗内异症及子宫腺肌病的新靶标

3.1内异症、子宫腺肌病中医药干预策略 内异症、子宫腺肌病属于祖国医学“痛经”“癥瘕”等范畴。中医认为子宫腺肌病主要病机为经血不循常道，离经之血蓄积胞宫而成，即血瘀为本，瘀血阻滞，不通则痛。女子一生以血为本。《景岳全书·妇人规》妇人之癥由“瘀血留滞”所致，究其缘由不外乎经期产后内伤外寒，或情志伤肝、伤脾或积劳羸弱引起气滞或气虚而致血行不畅滞留，积累成癥。早在1990年，全国同道通过中国中西医结合学会妇产科专业委员会第三届学术会议将内异症辨证为“血瘀证”。瘀血阻滞是内异症及子宫腺肌病的主要病机[39-40]，血瘀体质既是子宫腺肌病的危险体质[41]，又是重度内异症痛经患者最常见的体质[42]。有学者利用数据挖掘的形式分析内异症、子宫腺肌病的中医用药规律，提示活血化瘀药为最常用的类型[43-44]。因此在治疗时需时刻把握以“血瘀”为核心病机，以“化瘀消癥、活血止痛”为主要治则。通常内异症和子宫腺肌病患者病程较长，久病耗损正气，正气不足是以营血行走迟滞或失去气之固摄而溢出脉外，而成离经之血；气虚则卫气亦不足，机体防卫功能下降，离经瘀血难以清除，积累成癥。瘀血又阻塞经脉，使气行不畅滞涩经脉。因此气虚/气滞与血瘀之间形成难以斩断的恶性循环，病情更加缠绵难愈。因此需在一众活血之品中酌加益气扶正/行气理气之品以辅佐化瘀消癥之功。

3.2中药调控内异症EMT 目前关于中药干预子宫腺肌病EMT机制的研究尚属少见。而近年来，关于中药调控内异症EMT的作用主要关注中药干预后腺上皮标记物E-cadherin和间质表型标记物N-cadherin、Vimentin等表达的变化，以此评估异位病灶细胞侵袭和迁移能力的改变。朱小琳等[45]观察黑龙江中医药大学韩延华教授经验方“内异止痛方”对内异症大鼠E-cadherin的影响发现，以“三棱丸”为君药的“内异止痛方”具有上调E-cadherin，加强细胞间黏附，维持细胞间稳定性的作用。苏晓华等[46]发现天津中医药大学二附院院内中药制剂妇痛宁(丹参、三棱、鳖甲、海藻、薏苡仁、皂角刺)可提高内异症裸鼠异位病灶E-cadherin转录及蛋白表达，降低病灶侵袭转移能力[46]。上海中医药大学附属曙光医院戴德英教授根据“清热活血散瘀、理气止痛”治法组建中药经验方“红藤方”，方中君药红藤清热解毒、活血止痛，蒲黄化瘀止血，临床反响较好。在探索其治疗机制时发现，“红藤方”通过减少异位包囊壁中E-cadherin和Vimentin的表达，抑制间质细胞的增殖，从而缩小异位包块大小[47]。罗氏内异方为岭南中医妇科名家罗元恺教授的经验方。此方以益母草等活血化瘀药为君；蒲黄等行气活血药为臣，可有效提高内异症大鼠E-cadherin表达，降低异位细胞迁移，减少异位病灶浸润性生长[48]。

研究发现中药单体也能有效地干预EMT。大黄功在逐瘀痛经，其有效成分大黄素作用于异位子宫内膜间质细胞48 h后，间质表型N-cadherin、Vimentin明显降低，而上皮表型E-cadherin、keratin明显提高，这一效应具有时间依赖性和浓度依赖性[49]。姜黄素是破血行气中药姜黄的有效活性成分，研究显示姜黄素可降低异位内膜中Twist表达，升高E-cadherin表达，抑制内异症模型大鼠异位内膜的生长[50]。活血化瘀依赖气机的充沛且顺畅，正如《医林改错》指出的：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”。因此益气活血化瘀也是治疗内异症的常用治法。大补元气的人参活性成分人参总皂苷Rg3通过抑制内异症大鼠子宫内膜血管内皮细胞E-cadherin进而抑制血管生成[51]。

3.3中药调控内异症、子宫腺肌病Wnt/β-catenin通路 姜心禅等[52]以“缓急止痛、活血化瘀”为治则的加味芍药甘草汤干预体外培养子宫腺肌细胞发现，加味芍药甘草汤通过抑制β-catenin 在核内的表达，降低EGFR磷酸化水平，促进子宫腺肌细胞凋亡并抑制迁移。活血化瘀中药的另一种单体成分大黄酸通过增加垂体移植子宫腺肌病模型大鼠子宫病灶间质细胞内β-catenin的降解物，控制β-catenin入核，进而抑制EMT相关蛋白Snail的激活[53]。周华等[54]以“化瘀解痉止痛、活血化瘀消肿、补肾活血助孕”为治疗大法组成“消瘤方”，给内异症大鼠连续灌胃4周后发现无论是在位内膜还是异位内膜，细胞中Wnt7a、β-catenin蛋白均明显下降，并伴随着异位病灶的萎缩。黄映红等[55]以“清湿化瘀、行气止痛、消癥散结”为法组成内异康复片干预内异症大鼠，发现内异康复片通过抑制Wnt进一步抑制异位内膜细胞分泌VEGF、MMP-9以治疗内异症。还有学者深入研究中药对Wnt/β-catenin通路各环节作用靶点。李霞等[56]给内异症患者口服复方莪术散3个月后，患者异位内膜中Wnt、Frizzled、Dsh、β-catenin蛋白及mRNA转录均显著下降，提示以“扶正祛邪、活血化瘀”为主要功效的复方莪术散具有抑制Wnt/β-catenin通路的作用。韦佳慧[57]受经典名方“佛手散”启发，以中药单体川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素组成“内异消”在内异症裸鼠模型中通过Wnt通路上调GSK3β、磷酸化-β-catenin蛋白的表达，下调Wnt3a、磷酸化-GSK3β、β-catenin表达，进而促进E-cadherin蛋白表达，抑制N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达以影响上皮间质转化，降低异位病灶体积。

4 总结及展望

进行性加重的痛经是内异症和子宫腺肌病的主要症状，严重影响患者生活质量[58-59]。无论手术切除还是激素治疗都因各自的不良反应令患者接受度不高。中医药在缓解或消除痛经症状，诱导异位病灶萎缩，提高患者生活质量和生育能力，减少不良反应等方面显示了独特的优势[60]。研究表明Wnt/β-catenin通路的异常激活在内异症及子宫腺肌病EMT发生发展中发挥关键作用[61]。近年来中药复方及单体在调控内异症及子宫腺肌病Wnt/β-catenin通路及EMT取得一些进展。通过中药干预有效调控Wnt/β-catenin通路各环节作用靶点干预EMT有望成为治疗内异症及子宫腺肌病的新途径，丰富中医药治疗内异症及子宫腺肌病的现代科学内涵。目前有关中医药调控内异症及子宫腺肌病Wnt/β-catenin通路的研究仍占少数，未来研究方向应关注中医病-证结合模型Wnt/β-catenin通路与EMT机制的转变特点，以及中药有效成分与通路作用靶点的启动机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。