铁自噬及其在缺血再灌注损伤中作用机制的研究进展

李冰玉，赵博，夏中元

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉430060)

缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)可发生在心、脑、肺、肠、肾等器官，是影响心肌梗死、脑梗死等危重疾病预后的重要因素[1]。IRI的病理机制复杂，包括血供恢复后继发活性氧大量产生、线粒体功能障碍、细胞内离子代谢失衡、自噬凋亡等程序性细胞死亡、兴奋性氨基酸的毒性作用以及炎症反应等[2]。近年来，铁死亡在IRI中的重要作用逐渐受到关注[1-2]。铁死亡是一种以脂质过氧化为特征的铁依赖性细胞程序化死亡方式，被定义为铁代谢紊乱导致的脂质活性氧堆积而引发的细胞死亡，形态学上表现为线粒体皱缩变小、线粒体膜密度增加及线粒体嵴减少或消失等[3]。铁代谢以及活性氧的产生与清除失衡是铁死亡在IRI中发挥作用的基础[4]。铁自噬与铁死亡作为铁代谢调节的两条重要途径联系紧密，有研究发现，铁自噬是诱导铁死亡所必需[5-6]，铁死亡发挥作用时铁自噬往往参与其中[7-8]。铁自噬也参与IRI的过程，且铁自噬与IRI中氧化应激、铁死亡、铁超载等关键病理生理机制密切相关[5-9]。现就铁自噬与IRI的研究进展予以综述，以期为后期基础研究及临床治疗提供参考。

1 铁自噬概述

1.1铁自噬概念的提出 铁自噬是一种调控铁离子代谢的特殊自噬。作为人体中铁的主要存储形式之一的铁蛋白，由核受体辅激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)这一选择性运载受体介导，被转运至自噬小体内并通过自噬体-溶酶体途径降解，释放出铁离子。Mancias等[10]通过定量蛋白质组学对自噬体中包括运载受体在内的所有蛋白质进行分析，发现NCOA4与铁蛋白密切相关，从而首次发现并命名了铁自噬这一过程。

1.2铁自噬水平的调节 铁自噬水平由NCOA4水平决定，而NCOA4水平又受细胞中铁水平调节，泛素-蛋白酶体途径在其中发挥的作用有待进一步研究。正常生理情况下，当细胞内铁水平较高时，NCOA4以铁依赖的方式与E3泛素连接酶HERC2相互作用，并通过泛素-蛋白酶体途径靶向降解，因此NCOA4水平降低，从而铁自噬水平降低；反之，细胞铁水平较低时，NCOA4水平和自噬水平升高，以补充细胞可利用铁[11]。同时，纯化蛋白质研究发现，铁水平升高还能够抑制NCOA4与铁蛋白结合，从而进一步抑制铁自噬发生[12]。然而，在通过脂多糖诱导脓毒症时，铁自噬水平上调并诱发铁死亡，此时应用泛素-蛋白酶体途径特异性的抑制剂不会影响铁蛋白水平[13]，即在脓毒症模型中泛素-蛋白酶体途径可能并没有参与脂多糖诱导的铁蛋白降解，但也不能排除应激状态下铁蛋白表达增加抵消铁自噬对铁蛋白的消耗，但具体机制有待进一步研究。

在非生理状况下，铁自噬水平变化可能表现为上调、受抑制甚至不变。在胰腺导管腺癌中，泛素E3连接酶三基序蛋白质11可抑制铁自噬[14]，而抗真菌药物环匹罗司可促进铁自噬发生[15]，在胰腺癌细胞中使用erastin后铁自噬水平无变化[16]。病理条件下铁自噬水平变化仍不明确，药物干预对铁自噬的影响也有待进一步研究。

1.3铁自噬与铁死亡的关系 铁自噬与铁死亡密切相关，目前大多数研究提示铁自噬是调控铁死亡的重要环节，铁自噬水平上调可促进铁死亡的发生，铁自噬水平下调则可抑制铁死亡。Hou等[16]发现敲除或敲低自噬相关蛋白5和自噬相关蛋白7可抑制 erastin诱导的铁死亡，表现为细胞内游离铁水平降低，脂质过氧化减少，谷胱甘肽水平增加；而基因沉默NCOA4同样可抑制铁蛋白降解和铁死亡，细胞内游离铁水平和氧化应激水平降低，谷胱甘肽水平增高；NCOA4过表达则促进铁蛋白降解和铁死亡。来自血管内皮细胞的外泌体可通过抑制铁自噬来拮抗糖皮质激素诱导的骨质疏松症，从而抑制成骨细胞的铁死亡[17]。然而，在Gryzik等[18]应用NCOA4基因表达调控技术及多种铁死亡诱导剂对多种品系细胞进行的实验研究中，虽然大多数实验结果支持铁自噬对铁死亡具有调控作用，但在HeLa细胞中表现出Ras选择性致死化合物3诱导的铁死亡水平与铁自噬水平无关。因此，在大多数情况下，铁自噬对铁死亡具有调控作用，但在特定的组织、细胞及病理生理背景下，铁自噬与铁死亡的关系仍不明确。

铁死亡对铁自噬的作用尚不明确，在不同铁死亡诱导剂作用下，铁死亡水平上调，但NCOA4介导的铁自噬水平变化不同。索拉非尼处理后肝星状细胞中NCOA4表达增加[6]，而在胰腺癌细胞中厄拉汀治疗前后的NCOA4表达无差异[16]，使用青蒿琥酯后，肝星状细胞中NCOA4表达水平及铁自噬水平甚至降低[19]，提示铁死亡对铁自噬可能无特定调控机制。在这些研究中，应用铁死亡诱导剂后铁自噬水平变化表现出的复杂性是否与特定细胞、病理生理背景及化合物有关仍有待探究。

1.4铁自噬在铁代谢中的作用 NCOA4及其介导的铁自噬过程在调节机体铁代谢、维持铁稳态中发挥重要作用。铁可作为合成血红蛋白的关键组分参与氧的结合及运输，作为辅酶参与神经递质的合成，作为柠檬酸循环和电子运输的辅酶因子参与ATP的产生、DNA的生物合成及修复等，维持铁代谢的平衡对机体至关重要[20]。敲除NCOA4后观察到因铁缺乏导致的血红蛋白合成障碍与小细胞低色素性贫血，表明NCOA4对调控铁代谢具有重要作用[11，21]。另外，实验观察到铁蛋白的蓄积以及血清铁减少的机制可能为NCOA4缺乏导致铁自噬无法完成，即铁蛋白无法正常降解释放出细胞可利用铁；为维持正常生理活动，机体消耗血清铁，导致血清铁减少，并由于缺铁导致小细胞低色素性贫血[11，21]。由此可见，NCOA4介导的铁自噬在铁代谢的调控中发挥重要作用，铁自噬水平的改变可引起铁代谢紊乱，从而诱发疾病。

2 铁自噬在IRI中的作用

NCOA4介导的铁自噬作为调节铁代谢的重要途径，在神经变性疾病、缺铁性贫血等疾病中均有重要作用，此外，铁自噬还在多种脏器中参与IRI的发生发展过程[20]。心、脑、肾等脏器发生缺血再灌注后，在宏观层面表现为受累组织坏死，受损细胞死亡；在微观层面则观察到受累细胞中NCOA4表达增加，铁自噬水平上调，因而组织细胞中游离铁增加，同时自噬小体增多、线粒体形态发生皱缩等改变，活性氧大量产生，细胞内还原性物质谷胱甘肽等减少，氧化还原产物丙二醛等增加，铁蛋白水平表现为先降低后升高至高于正常水平的动态变化[8，22-24]。研究发现，铁蛋白信使RNA水平在再灌注发生后24 h内随时间推移不断升高，且游离铁水平增高可导致铁调节蛋白失活进一步促进铁蛋白翻译，因此铁蛋白水平的特殊变化可能是铁蛋白表达水平升高和降解增多综合作用的结果[8，25]。然而，作为铁储存形式的铁蛋白生成增加并未引起游离铁减少，其原因可能与铁代谢的其他调节机制有关，缺血再灌注后铁代谢变化的具体机制仍有待研究。

选择性抑制铁自噬可以显著减轻IRI。在缺血再灌注病理条件下，基因沉默铁自噬的关键蛋白NCOA4可导致脑组织梗死体积减小，神经功能评分升高，且与未进行NCOA4敲除的神经元相比，NCOA4敲除的神经元谷胱甘肽水平和谷胱甘肽过氧化物酶活性升高，丙二醛水平降低，发生皱缩的线粒体减少[8]。表明铁自噬被阻断后，缺血再灌注细胞中的氧化应激水平降低，铁死亡也被显著抑制，同时细胞内游离铁水平下降，铁超载得到缓解。在心脏和肾脏发生缺血再灌注的病理条件下，同样观察到抑制铁自噬对IRI的显著改善作用[22-23]。自噬广谱抑制剂也可有效降低铁自噬水平，但并未发现IRI明显减轻，其原因可能为广谱抑制剂同时抑制了线粒体自噬，而线粒体自噬通过及时清除受损线粒体对IRI具有保护作用，铁自噬的损害性作用与线粒体自噬的保护性作用被同时抑制，从而表现为相互抵消的综合结果[8，26]。目前，铁自噬在IRI中的作用相关研究均为动物及细胞实验，且对IRI的作用仅通过器官组织坏死体积、细胞生存情况及粗略的功能评分进行评估，对器官功能变化的检测及预后分析等关注不够，可能成为未来的研究方向。

在缺血再灌注发生后，铁自噬水平上调可能存在与生理条件下不同的调节机制。再灌注后，介导NCOA4降解的E3泛素连接酶HERC2表达水平并未下降，表明再灌注后NCOA4蛋白水平增高的原因并非是降解减少，仍存在其他途径[8]。铁自噬水平上调的启动时机尚不明确，但可以排除单纯的缺氧，相反，缺氧条件下铁自噬水平下调[27-28]。其原因可能为缺氧条件下铁自噬的关键蛋白NCOA4转录水平下调，且NCOA4的信使RNA被miR-6862-5p持续降解进一步导致铁自噬水平受抑制[27]。此外，缺氧还可能通过抑制核因子κB受体活化因子配体导致铁自噬水平下调[28]。

3 铁自噬在IRI中的作用机制

铁自噬在帕金森病、尿路感染等中有重要作用，其作用机制均基于铁自噬调控铁代谢的作用[20]。目前铁自噬参与IRI的机制尚未完全阐明，可能与铁死亡、活性氧大量生成及铁超载等有关，同时这三者之间也通过铁代谢紧密联系。

3.1铁自噬与铁死亡 在缺血再灌注期间，铁死亡水平上调，具体表现为谷胱甘肽、胱氨酸谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11和谷胱甘肽过氧化物酶4表达降低，活性氧及氧化产物增多，线粒体皱缩，受累细胞存活率降低，受累组织坏死等[22，24]。有研究发现，高良姜素可通过激活胱氨酸谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11-谷胱甘肽过氧化物酶4轴使谷胱甘肽过氧化物酶4的表达增加，铁螯合剂(如去铁胺)则可减轻IRI[29-31]。

在多种不同细胞及病理生理背景下，铁自噬水平上调均可促进铁死亡的发生，在IRI发生过程中，铁自噬对铁死亡同样存在调控关系[8，13，22-23]。脑缺血再灌注发生后，在泛素特异性肽酶14的去泛素化作用下，缺血再灌注的神经细胞中NCOA4表达上调，泛素特异性肽酶14抑制剂则可阻断NCOA4介导的铁自噬，此时铁死亡水平下降，IRI减轻，可能成为临床应用的有效靶点[8]。在肾IRI发生期间也观察到了同样的现象，Sui等[23]发现，再生人冷诱导RNA结合蛋白可与胚胎致死性异常视觉样蛋白1相互作用，并激活铁自噬从而促进铁死亡，通过抑制铁自噬可减轻肾IRI。在糖尿病心肌IRI期间，通过干扰小RNA进行NCOA4基因敲除，可以抑制铁自噬和铁死亡，从而减轻糖尿病心肌IRI；同时，通过抑制DNA甲基转移酶1可以抑制铁死亡并减轻糖尿病心肌IRI，NCOA4介导的铁自噬也参与这一过程[24]。在心、脑、肾等多器官的IRI相关研究中，无论是离体还是在体实验，铁自噬在IRI期间发挥的作用均与铁死亡密切联系。

在IRI发生期间，铁自噬促进铁死亡的机制可能与铁自噬释放的铁离子及其促进氧化应激导致活性氧大量生成有关。这与erastin和Ras选择性致死化合物3等铁死亡的常见激活剂发挥作用的核心机制不同，激活剂大多为阻碍活性氧的清除[31]。首先，铁死亡的发生与铁水平有关，过表达热激蛋白β1基因或沉默转铁蛋白基因可降低铁水平，从而抑制铁死亡，而通过补充铁可以加速铁死亡[32]。当铁自噬激活、NCOA4水平升高时，释放铁增加导致的铁水平升高可以促进铁死亡，这可能是铁自噬促进铁死亡的机制之一。此外，铁死亡的发生与氧化应激密切相关，铁死亡的特征即为脂质过氧化积累到致死水平。而铁自噬通过释放的铁离子催化Fenton反应产生大量活性氧，促进铁死亡的发生[33]。在其他应激条件下也观察到相似的过程，Li等[13]发现，脂多糖作用下的心肌细胞中铁自噬水平上调并释放出大量Fe2+，此时细胞中线粒体膜上的丝氨酸转运蛋白SFXN1(sideroflexin 1)的信使RNA和蛋白表达均升高，大量Fe2+与SFXN1结合并被转运至线粒体，再通过Fenton反应产生大量活性氧，从而促进铁死亡的发生；而当铁自噬受到抑制时，SFXN1表达下调，铁死亡受到抑制。同时，铁离子作为脂氧合酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶等氧化酶必不可少的组成部分直接参与氧化应激过程，这也可能是铁自噬促进铁死亡的机制之一。在缺血再灌注后，铁死亡水平上升，在缺氧条件下则受到抑制，这与铁自噬水平的变化一致[34]。器官缺血时往往因携氧血红蛋白无法正常运输氧气，从而伴随着组织细胞缺氧。在缺氧条件下，NCOA4表达降低，铁自噬受抑制，线粒体铁蛋白上调，而铁蛋白重链和线粒体铁蛋白可以保护细胞减少铁死亡的发生[27]，这可能是在缺血再灌注期间铁自噬调控铁死亡的另一个原因。此外，还可能存在更复杂的机制，值得进一步探究。

有研究提出铁自噬在IRI中的作用可能全部基于铁死亡，但证据不足。Li等[8]对NCOA4敲除的脑缺血再灌注模型使用铁死亡抑制剂，结果与未敲除NCOA4且未给予铁死亡抑制剂的缺血再灌注模型组相比IRI显著减轻，但与仅给予铁死亡抑制剂未进行基因敲除的缺血再灌注模型组相比，脑梗死体积及神经功能评分改善不显著；在细胞实验中表现为给予铁死亡抑制剂条件下，敲除NCOA4组与未进行基因敲除组缺血再灌注后神经元存活数量比较差异无统计学意义。但该研究仅从神经元存活数量、脑梗死体积和神经功能评分三个方面进行讨论，并不代表细胞器和分子水平无变化，氧化应激水平及游离铁等更能反映出微观变化的指标，有待进一步分析。

3.2铁自噬与活性氧生成 氧化应激产生大量活性氧是IRI的经典病理途径，以往研究发现可能的机制包括线粒体内氧化还原反应产生活性氧增加，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶表达上调，白细胞呼吸爆发，血管内皮细胞黄嘌呤氧化酶形成增加，儿茶酚胺自氧化，体内清除活性氧的能力下降等[1,35]。

在IRI期间，铁自噬也参与活性氧的产生。在糖氧剥夺复氧复糖神经元中，细胞中的还原性物质谷胱甘肽显著减少，谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，氧化应激产物丙二醛增加；NCOA4敲除后，谷胱甘肽含量增加，谷胱甘肽过氧化物酶活性升高，丙二醛水平降低[8]。铁自噬的关键运载蛋白NCOA4可将储存铁的铁蛋白转运至溶酶体，并转化为游离铁[10]。在溶酶体中，由于众多含铁大分子(如铁蛋白)、细胞器(如线粒体)降解，溶酶体内积聚大量铁；且溶酶体内的酸性环境和还原环境导致铁多以具有催化活性的Fe2+形式存在。溶酶体内的大量有催化活性的铁可与线粒体中少量逸出的过氧化氢产生Fenton反应，而缺血再灌注可使线粒体生成大量超氧化物和过氧化物，从而放大了线粒体与溶酶体之间的串扰现象[35]。Fenton反应生成的羟自由基又继续攻击溶酶体膜，破坏溶酶体膜的完整性，这导致多种水解酶和更多具有催化活性的Fe2+被释放到细胞质，进一步产生大量活性氧损害细胞[36]。同时，Qin等[7]研究发现，源自线粒体的活性氧可能通过激活AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和unc-51样自噬激活激酶1轴而触发铁自噬，导致胞内游离铁及活性氧的进一步增加。一些铁螯合剂发挥的显著抗肿瘤作用与溶酶体中铁蛋白的降解有关，其中一种可动员铁蛋白内铁、促进铁自噬的新型铁螯合剂二-2-吡啶基酮二硫代氨基甲酸酯发挥的抑制癌细胞增殖作用，也被证明与促进癌细胞内铁自噬介导的溶酶体内活性氧生成有关[37]。有研究认为，铁死亡启动所需的活性氧也源于铁自噬产生的活性氧[33]。

铁自噬不仅参与并加剧活性氧的产生，且可能将活性氧的产物向毒性更强的方向转化，导致并加重缺血再灌注过程中氧化应激损伤。活性氧包括自由基、单线态氧、过氧化氢、一氧化氮以及脂性过氧化物等，其中自由基包括氧自由基、脂质自由基、氯自由基以及甲基自由基等，氧自由基包括超氧阴离子和羟自由基等。一般来说，线粒体中的活性氧主要是超氧化物和过氧化物[38]，而羟自由基主要是由于溶酶体或不稳定铁池中发生Fenton反应所致[33]。人体内正常或非正常代谢产生的超氧阴离子和超氧阴离子在酶促作用下生成的过氧化氢对组织细胞的损伤作用均较小。但超氧阴离子和过氧化氢通过Fenton型Haber-Weiss反应，在Fe2+的催化下可以转化为毒性更强、更活跃的羟自由基[33,38]。羟自由基可以使膜脂质过氧化，蛋白质骨架断裂，DNA发生碱基修饰、断裂和交联以及破坏细胞间质等，从而损害组织和细胞的正常功能[39]。

3.3铁自噬与铁超载 正常生理状态下，铁自噬可以维持组织细胞的铁代谢平衡，然而在缺血再灌注等应激因素作用下，铁自噬过度激活，导致细胞内铁超载[13]。在脑缺血再灌注后6 h以及缺氧缺糖复氧复糖的神经元细胞中均检测到游离铁显著增加，敲除NCOA4则未发现游离铁水平升高[8]。在心肌IRI期间，同样观察到大量铁积聚，但在NCOA4基因沉默组中，铁自噬关键蛋白缺失可导致铁自噬受到抑制，游离铁水平降低[24]。在IRI期间，除铁自噬过程本身因降解铁蛋白会增加胞内游离铁引发铁超载外，活性氧大量产生与铁死亡的发生也可能导致铁超载[3]。

铁超载与2型糖尿病、高血压、心肌肥大、骨质疏松、非酒精性脂肪性肝病等代谢性疾病相关，且在不同器官组织中铁超载表现出的损伤不同。一项研究建立了2例神经铁蛋白病患者成纤维细胞诱导的多能干细胞系，并利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9系统建立了同基因对照，结果发现神经铁蛋白病组成纤维细胞、神经前体细胞和神经元的胞质铁含量增加，出现衰老表型，神经元的衰老尤为突出[40]。同时，铁超载可提高神经元自噬水平，其机制可能为铁超载激活自噬相关的AMPK通路，但不限于此。在通过连续28 d腹腔注射右旋糖酐铁构建的铁超载大鼠模型中，大鼠海马神经元内铁水平、转铁蛋白受体1表达及自噬小体数量明显增加，内质网肿胀明显，调控中枢神经系统自噬水平的关键因子AMPK活化，微管相关蛋白1轻链3Ⅱ、B细胞淋巴瘤/白血病-2相互作用蛋白1的表达明显增加，大鼠认知功能障碍明显[41]。有研究显示，通过小檗碱激活AMPK通路可抑制肾缺血再灌注小鼠的肾组织发生铁死亡，进而减轻肾纤维化[42]，这为干预铁死亡及铁自噬引发的铁超载提供了可能的干预靶点。在心肌中，氧化应激及铁超载是心肌肥大的重要因素，而铁自噬可介导这一过程，在心肌缺血再灌注后铁超载则可能导致线粒体结构异常以及功能障碍，从而导致损伤[43]。与IRI一致，铁超载也可发生在全身多个重要的器官组织，预防或减少铁的过度沉积可能是减轻IRI的重要措施。

以往虽然有较多基础研究应用铁螯合剂来减轻铁超载并取得肯定效果，但应用铁螯合剂调节铁代谢以减轻IRI的临床研究效果有限[2,4]，且研究本身存在诸多转化应用的限制，包括铁螯合剂本身的细胞毒性、铁受影响器官的螯合效率差异、使用铁螯合剂的具体时间、患者之间的异质性以及其他严重的脱靶副作用等[1-2]。这表明从临床应用转化角度考虑，铁本身可能不是用于调控铁代谢以减轻IRI的最佳靶点。

4 结 语

目前预防或减轻缺血再灌注导致的细胞及器官功能损伤仍是医学面临的难题。近年来，铁自噬作为一种新型的特殊类型自噬成为研究热点，铁自噬在IRI中的作用机制等逐渐受到关注，且仍值得进一步研究。铁自噬与铁死亡作为调控铁代谢的两个重要途径，具有诸多相似点与联系，铁死亡在多种疾病中的作用均与铁自噬有关，但两者间的调控关系及具体机制尚未完全明确。此外，铁自噬上游通路未完全阐明，目前尚未发现临床适用的抑制铁自噬通路的治疗措施。深入研究铁自噬，有望为IRI相关疾病提供新的临床治疗靶点。