泛素蛋白酶体系统在脑卒中后病理过程中的机制探讨

李煜超， 王 燕综述， 邹 伟审校

脑卒中又称中风,是一种急性脑血管疾病,其主要特征为脑部血管突然破裂或大脑供血中断引起脑组织损伤进而导致神经功能障碍,包括缺血性和出血性卒中。在全球范围内,卒中已成为仅次于缺血性心脏病的第二大死因。目前,研究发现泛素蛋白酶体系统参与了卒中发生和发展相关生物进程。此外,泛素蛋白酶体系统与造成卒中后神经损伤的许多信号通路存在联系。但是具体机制尚不明晰。本文探讨了泛素蛋白酶体系统参与脑卒中后相关病理过程的机制,为进一步研究泛素蛋白酶体系统和脑卒中的治疗提供理论依据。

1 泛素蛋白酶体系统

泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内蛋白质降解的主要非溶酶体途径,该系统不仅降解错误折叠或氧化的蛋白质,还降解具有基本功能的蛋白质,是生理和病理条件下维持蛋白质稳态的重要系统。UPS参与许多细胞过程,包括DNA修复,内吞运输和免疫反应。UPS对中枢神经系统疾病也非常重要。在阿尔兹海默症和帕金森病这类因异常蛋白积累而形成的神经退行性病变中,UPS参与了异常蛋白的清理[1]。另外,UPS还参与调控脑血管病的主要危险因素如动脉粥样硬化、高血压、高脂血症等。

2 UPS与脑卒中

UPS与脑卒中后相关的病理变化密切相关,包括线粒体损伤、氧化应激和炎症反应等。在缺血性卒中后,由于Ca2+超载或线粒体转换孔的打开等因素,最终导致线粒体功能障碍。而在脑出血中,线粒体呼吸功能障碍是导致脑出血后血肿中氧代谢减少的原因。对功能障碍线粒体的清除有助于神经细胞的生存。线粒体自噬是线粒体质量和数量的重要调控途径,而UPS在线粒体自噬的调控中起着重要作用[2]。线粒体是氧化能量中心,是细胞生存所必需的细胞器,而老化或受损的线粒体是有毒活性氧的来源。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是氧化应激中重要的信号分子,在脑卒中病理表现中,相对过量的ROS将破坏细胞内环境稳态,导致氧化应激和线粒体损害。Keap1-Nrf2途径是对氧化应激的主要保护反应,UPS可以通过该通路来严格调节转录因子Nrf2的转录,从而影响抗氧化过程。炎症是脑卒中后最常见的病理表现之一,可由多种原因引起。炎症的发生会引起神经毒性作用导致神经元死亡。有研究显示,UPS参与炎症的调控。调节UPS可能是控制炎症的有效途径。因此,在卒中过程中,通过UPS调控相关通路及其关键蛋白可能是保护神经元和防止细胞死亡的有效解决方案。

3 泛素蛋白酶体系统的调控机制

3.1 NF-κB通路与泛素蛋白酶体系统 在静息状态下,NF-кB与抑制因子IкB相结合以无活性的潜在状态存在于细胞浆中。NF-кB信号通路主要包括经典和非经典激活途径。在经典的NF-кB信号通路中,当细胞受到促炎因子、生长因子、免疫受体配体及应激反应等刺激时,IKK复合体被激活。活化的IKK能特异地催化IκB特定部位丝氨酸(serine,ser)残基的磷酸化。IκB的磷酸化导致其氨基端第21和22位赖氨酸残基通过SCF型E3泛素连接酶复合物与多个泛素分子共价结合,这种结合使IκB的空间构象发生变化,导致其被ATP依赖性26S的蛋白酶体所识别并降解[3]。当抑制因子IκB与NF-κB解聚后,释放的NF-κB二聚体通过各种翻译后修饰被进一步激活,导致炎症细胞因子如TNF-α、IL-2、IL-6和INF-γ的产生和释放。非经典的NF-кB途径激活依赖于受体激活激酶NIK,NIK可激活IKK复合体中的IKKα亚基。应激条件下,活化后的IKKα可将NF-κB2 p100的C端残基磷酸化,随后导致其自身的泛素化,经蛋白酶体识别并部分降解为p52,最终p52-RelB异二聚体进入细胞核启动转录[4]。促炎细胞因子和其他炎症介质的过度产生会促使组织损伤,NF-κB作为调节炎症过程中促炎基因表达的中枢转录因子,在急、慢性炎症性疾病中发挥重要作用。

3.2 PINK1/Parkin通路与泛素蛋白酶体系统 Parkin是一种E3泛素连接酶,而PINK1作为Parkin的上游因子,对激活Parkin和将Parkin招募到去极化线粒体上都至关重要。在生理情况下,PINK1的跨膜段部分被位于内膜的早老素相关菱形蛋白(presenilins-associated rhomboid-like protein,PARL)以蛋白质水解方式切割,被切割的PINK1在其N端暴露不稳定的氨基酸残基,并释放到细胞质,E3泛素连接酶(UBR1、UBR2和UBR4)以N端规则将其泛素化后通过蛋白酶体迅速降解[5]。当线粒体膜电位出现异常时,PINK1逃避了PARL介导的切割和N端规则依赖性降解,稳定地与外膜转位酶(translocase of the outer membrane,TOM)结合,并积聚在线粒体外膜(mitochondrial outer membrane,MOM)上。在MOM上积累的PINK1可以通过两种方式激活Parkin。一方面,PINK1通过直接磷酸化Parkin的UBL结构域中的Ser65激活Parkin[6]；另一方面,PINK1磷酸化在基础水平时与MOM结合的泛素的Ser65。Parkin对磷酸化泛素的高度亲和力促使其定位于线粒体。被激活的Parkin进一步将泛素结合到MOM蛋白上,随后泛素又会被PINK1磷酸化[7]。PINK1生成的磷酸化泛素作为线粒体上的自噬信号,而Parkin将其放大。随后,被泛素化的MOM蛋白招募自噬衔接蛋白SQSTM1/P62到受损线粒体,通过自噬促进其降解。在PINK1/Parkin途径中存在着一些与UPS相关的负性调节机制,这对线粒体自噬的稳定非常重要。泛素特异性蛋白酶30(Ubquitin-specific protease 30,USP30)是一种定位于MOM的去泛素化酶,USP30的存在可以维持MOM蛋白泛素化的稳态,防止过度的线粒体自噬[8]。

3.3 Keap1-Nrf2通路与泛素蛋白酶体系统 核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid2-related factor,Nrf2)是氧化还原和代谢稳态的主要调节因子,具有7个Nrf2-ECH同源结构域(Neh1-Neh7),每个结构域都具有不同的功能。其中Neh2作为Nrf2最重要的调控结构域,包括两个基序DLG和ETGE,它们可通过与其他蛋白质(如Keap1)的结合来调节Nrf2的稳定性和泛素化[9]。在正常条件下,Nrf2的Neh2结构域通过DLG和ETGE基序的介导在细胞浆中与Keap1中的Kelch/DGR域相互作用,Keap1-Cul3-E3泛素连接酶靶向定位于Nrf2 N端的Neh2结构域的多个赖氨酸残基,并促进Nrf2的泛素化,泛素化后的Nrf2被递送至26S蛋白酶体进行降解[10]。氧化应激条件下,Keap1中的关键半胱氨酸残基(cysteine,Cys),尤其是Cys151,充当损伤细胞的传感器,并被亲电物质或ROS共价修饰[11]。这种修饰可能通过破坏Kelch结构域和DLG基序之间的低亲和力相互作用,从而诱导Keap1的构象变化,导致Nrf2泛素化受损,阻断UPS介导的降解,增加Nrf2蛋白水平[12]。

4 脑卒中后UPS在信号通路中的作用

4.1 泛素蛋白酶体系统调控的PINK1/Parkin通路与脑卒中 在脑卒中引起的线粒体功能障碍时,PINK1/Parkin通路介导功能障碍MOM蛋白的泛素化,随后通过与自噬的串扰清除异常线粒体。事实上PINK1/Parkin通路介导的线粒体泛素化是线粒体自噬的基础,非活性PINK1不能激活或招募Parkin到线粒体[13]。阻止Parkin的线粒体易位,减少Parkin磷酸化,降低磷酸化泛素水平,可以抑制各种线粒体损伤因子诱导的线粒体自噬[14]。Rakovic等研究发现[15],MOM蛋白可以通过不依赖自噬的UPS途径降解。较大的MOM蛋白MFN2和TOM70仅通过UPS降解。同时,较大MOM蛋白的降解影响了MOM的稳定性导致其破裂,最终导致线粒体内膜和基质蛋白的二次降解[16]。在氧葡萄糖剥夺(OGD)神经模型中,与对照组相比,PINK1敲除组更容易受到缺血损伤[17]。另外,在创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)中,Parkin的缺失会增加ROS的产生,促进氧化应激,进一步导致神经元死亡[18]。缺血诱导的大鼠模型的海马神经元中,PINK1/Parkin介导的线粒体自噬起到神经保护作用[19]。这说明,PINK1或Parkin基因缺失都会加重神经元损伤,而在脑卒中后,提高PINK1和Parkin的表达可以避免大量神经细胞死亡。因此,在后续研究中有必要关注PINK1/Parkin/UPS机制在脑卒中后线粒体损伤中的作用。

4.2 泛素蛋白酶体系统参与NF-κB通路与脑卒中 UPS可通过调控多种炎症调节蛋白,在炎症过程中发挥重要作用[20]。脑缺血再灌注过程中,细胞受到氧自由基等因素的刺激,激活IKK,引起IкB磷酸化和泛素化,最终被蛋白酶体识别并降解,NF-κB入核引起炎症基因的转录和表达。脑损伤时IKKα/β被激活,导致IκB的蛋白酶体降解,从而促进NF-κB转入细胞核,引发炎症[21]。在卒中急性期,迷走神经刺激可以通过抑制小胶质细胞中的NF-κB通路促进M2小胶质细胞极化并抑制M1小胶质细胞极化以减轻脑损伤[22]。由此可知,抑制NF-κB的活性,可以减轻脑出血或脑缺血后的神经损伤[23]。UPS与NF-κB的激活有关,通过干预UPS可以阻止IκB降解,抑制NF-κB的活性,使NF-κB与IκB结合在细胞溶质中,并且能够有效减轻脑缺血后的炎症反应和再灌注损伤[24]。Phillips等对局灶性脑缺血模型大鼠应用蛋白酶体抑制剂PS519,发现PS519可减轻脑损伤大鼠的炎症并改善神经功能恢复[25]。研究发现,虽然早期干预UPS在转录水平抑制NF-κB过度表达具有神经保护作用,但长期蛋白酶体活性降低与细胞内蛋白聚集和迟发性神经元变性以及死亡有关[26]。说明UPS可能对缺血后的神经元发挥双重作用。提示我们尽管蛋白酶体抑制剂已被证明可在脑缺血中提供保护,但因蛋白酶体活性下降导致的其他神经损伤问题不能被忽略。

4.3 泛素蛋白酶体系统通过Keap1-Nrf2参与脑卒中 Nrf2从Keap1抑制中逃逸是Nrf2介导激活的关键事件。脑缺血或脑出血期间,氧化应激使Keap1构象发生变化,Nrf2解离并转移至细胞核与ARE结合,激活下游抗氧化酶等细胞保护蛋白的因表达。研究表明,缺血脑组织中Nrf2表达显著上调,多种Nrf2诱导剂在脑缺血后均具有神经保护作用[27]。富马酸二甲酯(DMF)的直接代谢产物富马酸一甲酯可直接修饰Keap1的Cys151,促进Nrf2解离起到神经保护作用[28]。此外,在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中,miR-7可靶向抑制Keap1 mRNA的翻译,从而阻止Nrf2蛋白的降解,增加Nrf2的表达量起到细胞保护作用[29]。虽然这些试剂还需在脑卒中模型中进一步研究,但是不可否认的是,在脑卒中后神经元保护方面,通过对Keap1的修饰或抑制,阻止Nrf2被蛋白酶体降解是一个有前景的措施。

5 展 望

UPS是细胞溶质、核蛋白和跨膜蛋白降解的主要途径,也是维持神经发育、大脑结构和功能的主要调节器。脑卒中后,由于神经元生存的内环境被破坏,引起一系列神经元损伤事件,最终引起神经细胞死亡,导致神经功能丧失。近年来,对UPS的相关研究越来越多。研究发现UPS介导的蛋白质降解是机体调节细胞内蛋白水平与功能的重要机制,参与这一生物学过程的成分主要包括泛素及其相关启动酶,UPS对维持细胞稳态具有十分重要的作用。目前,脑卒中相关生理病理机制研究有较多研究成果,然而关于UPS与脑卒中的探讨不足,缺乏可供参考的文献。尽管如此,它仍然可能成为基础研究和潜在临床应用的新热点。需要注意的是,泛素化蛋白质的聚集是脑卒中后的重要特征之一[30]。UPS与线粒体自噬、氧化应激以及炎症反应等脑卒中后相关病理变化的通路的联系非常密切。研究UPS在PINK1/Parkin、NF-κB、Keap1-Nrf2等通路的调节机制,对于脑卒中患者的临床治疗及预后有重要意义。

目前,还有许多问题需要更多的实验进行研究,从维持稳态角度看,需要明确如何适度的激活或抑制UPS来发挥细胞保护作用。脑卒中病理过程是一个动态的过程,需要注意分期分阶段观察UPS的变化。由于缺乏对实验动物药物副作用的研究和临床试验的结果,UPS调节药物是否介导脑卒中后的细胞保护或细胞毒性的结论依然存在争议。深入探讨UPS与脑卒中之间的关系及其发生机制,对改善脑卒中患者的预后有巨大潜力。