microRNA调控缺血性脑卒中小胶质细胞激活作用的研究进展

聂晨晨, 袁 洁, 凡勇福, 阮晓迪综述, 苏凯奇, 冯晓东,2审校

缺血性脑卒中是全球最常见的死亡与致残原因,占所有卒中的75%～80%[1]。严重影响患者的生存质量。组织型纤溶酶原激活目前虽作为脑缺血损伤公认且有效的治疗手段,但其具有治疗时间窗短、再通率低等弊端。中枢神经系统固有免疫细胞-小胶质细胞,在脑缺血损伤早期,激活的小胶质细胞起吞噬碎片作用；随着炎症反应及炎性细胞的进一步释放,其被过度激活,进一步加重炎症反应的发生,引起脑缺血后神经元的损伤、加剧血脑屏障破坏和脑水肿。有研究表明[2]小胶质细胞介导脑缺血损伤的炎症反应与M1与M2表型极化有关。目前,关于小胶质细胞表型改变的分子机制尚未明确,现有大量研究证实[3,4]microRNA(miRNA)可调控小胶质细胞的激活、表型转化及炎症因子的表达。本文将从miRNA调控小胶质细胞激活及表型转化方面进行介绍,旨在为脑缺血临床治疗开拓新视角。

1 小胶质细胞激活与双重作用

19世纪末小胶质细胞被称为杆状细胞,起源于卵黄囊原始巨噬细胞,其更新依赖于自身增殖与凋亡的偶联过程,含量约占大脑组织的10%[5],多分布在灰质、海马体、基底节和嗅皮质中,是唯一一个永久驻留于中枢神经系统中的免疫细胞。小胶质细胞在脑缺血、缺氧环境下快速激活,激活后在释放嗜神经因子、吞噬有害物质的同时诱导大量促炎因子的释放。小胶质细胞对脑缺血损伤的保护作用取决于小胶质细胞中M2表型的极化。Choi等[6]研究发现M2型的小胶质细胞条件培养基导致缺血性脑卒中后同侧SVZ(侧脑室)中NSPCs(神经干细胞)的增殖与分化。在缺血损伤脑内早期注射小胶质细胞有助于M2型小胶质细胞发挥神经抗炎作用。小胶质细胞的M1和M2不同表型之间动态变化,对于脑组织损伤修复的调节起着重要的作用。

小胶质细胞在脑缺血时的损害作用与其过度激活、M1表型极化有关。在脑缺血损伤中,过度激活的小胶质细胞已被证明参与多种疾病中神经炎症的表达[7]。研究结果显示[8]通过减少小胶质细胞的表达,增加Bcl-2的表达数量,可提高细胞存活率。Yang等人发现[9]黄芩素通过降低JNK、ERK、p38的磷酸化水平、抑制NF-κB信号通路、降低炎性因子IL-6的释放,促使小胶质细胞向M2型的转化,有利于降低炎症反应。此外还可以通过抑制小胶质细胞M1型的表达,促进PI3K/Akt/mTOR信号通路的磷酸化,抑制细胞自噬。由此可见小胶质细胞的激活可促使细胞自噬、神经元凋亡。一项研究使用[10]时移双光子成像技术对MOCA大鼠小胶质细胞的激活进行动态监测,其结果显示小胶质细胞的增多伴随着血管生成的减少。在脑卒中早期,抑制小胶质细胞的激活,将有助于维持血脑屏障的完整性,其机制涉及炎症递质释放及相关通路的激活、细胞间的相互作用与氧化应激。以上结果均表明抑制小胶质细胞的过度激活及M1表型的转化有望成为脑缺血损伤治疗的有效靶点。

总之,及时抑制小胶质细胞的促炎表型表达可作为脑缺血损伤治疗的有效手段。此外,不同表型的极化在脑缺血损伤中具有时空分布特性。在恰当的时期给予干预有助于最大程度发挥小胶质细胞神经保护作用。

2 miRNA调节小胶质细胞在脑缺血损伤中的作用

MicroRNA作为一种长度为18～25个核苷酸的非编码RNA,通过诱导Dicer复合体降解mRNA或抑制mRNA的表达,从而影响某些转录因子、细胞因子的表达[11]。在一项临床实验[12]中采用miRNA高通量技术可观察到脑缺血环境下miRNA的变化,但是miRNA是否能够成为脑缺血后诊断与治疗的重要靶点一直是研究热点。依据miRNA在小胶质细胞中的具体作用,将miRNA分为:促进小胶质细胞激活及M1型转化与抑制小胶质细胞激活及M2型转化两种。

2.1 正向调控小胶质细胞激活与促使M1转化

2.1.1 miRNA let-7c-5p miRNA let-7c-5p作为人体最为丰富的miRNA,可通过调节细胞增殖与凋亡参与疾病的病理过程,Jingshu Ni等人[13]发现在BV2小胶质细胞以及脂多糖诱导的小胶质细胞中miRNA let-7c-5p的含量下降,提示活化的小胶质细胞伴随着Let-7c-5p的含量减少。该研究与MCAO小鼠体内Let-7c-5p的变化一致。当MCAO小鼠脑内过表达let-7c-5p时,脑梗死损伤体积减少,有利于脑缺血损伤的恢复。由此可见miRNA let-7c-5p可作为脑缺血损伤的治疗靶点,其机制为miRNA Let-7c-5p靶向结合在凋亡蛋白caspase 3 mRNA的3’-未翻译区抑制其表达,维持小胶质细胞静息状态。

2.1.2 MiRNA-200b 缺血性脑梗死若不及时治疗容易诱发脑水肿,不利于患者日后恢复。而大脑神经炎症因子的释放是缺血后脑水肿发生的重要机制。已有研究表明miRNA-200b的表达与脑缺血损伤密切相关,其高度上调可促进相关神经炎症因子释放。Wen等人[14]证实这一结论,在体内或体外实验中,注射高渗盐水能够通过抑制miR-200b的表达诱导小胶质细胞M2表型极化及减弱TNF-α、IL-1β及小胶质细胞M1标记物(iNOS、CD86)和miR-200b的表达。随后的荧光素酶报告基因测定Krüppel样因子4(Krüppel-like factor4,KLF4)为miRNA-200b在脑缺血损伤小胶质细胞作用中的靶基因。KLF4可在抑制NF-κB活化因子同时与Arg1、Stat6结合,诱发小胶质细胞M2型基因程序[15]。

2.1.3 miR-377 已有研究表明miR-377可成为脑缺血损伤的治疗靶点。Fan Y等人[16]发现在脑缺血损伤大鼠侧脑室内注射miR-377抑制剂,能够减少氧剥夺模型(OGD)下小胶质细胞的激活及相关促炎因子的释放,并且促使血管生成相关细胞的增殖与迁移。随后他们应用miRNA靶标预测分析证实ERG2、VEGF可作为miR-377的作用靶点,miR-377与EGR2、VEGF的表达水平呈负相关。EGR2[17]通过降低炎症因子表达量,抑制小胶质细胞活化在调控小胶质细胞介导的免疫反应中发挥着关键作用。此外,VEGF作为一种多效性血管生长因子,可诱导M2型小胶质细胞极化。并有研究表明VEGF可作为miR-377的直接靶点诱导血管生成相关细胞的增殖[18]。因而,抑制miR-377可抑制小胶质细胞过度激活、促进血管再生。

2.1.4 miR-3473b Wang X等人[19]发现MCAO小鼠同侧皮质、纹状体中miR-3473b水平显著增加。这与体外被脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)或OGD激活的小胶质细胞中miR-3437b的水平变化一致。经注射miRNA-3437b抑制剂的小鼠相比对照组而言,大脑同侧皮质及纹状体中的梗死体积显著减少且神经功能评分得以改善。进一步研究发现SOCS3(细胞因子信号抑制因子3)上存在miR-3437b的结合位点。SOCS3作为细胞因子诱导蛋白,能够对免疫细胞中细胞因子的信号传导产生抑制作用[20],尤其针对IL-6炎性家族。因此,miR-3437b可通过靶向抑制SOCS3的表达介导脑缺血损伤后小胶质细胞中的神经炎症。

2.1.5 miR-155 miR-155与小胶质细胞介导的免疫反应密切相关。最新研究表明[21]miR-155介导小胶质细胞在脑缺血损伤中的炎症反应,可归纳为以下几个方面：(1)miR- 155直接作用于SOCS-1(细胞信号抑制因子-1)、SOCS-6和SHIP-1,抑制细胞因子信号的传导,抑制小胶质细胞活化。其机制为miR-155直接结合到SOCS-1与SHIP中,减弱STAT-3的活性,其中STAT-3是小胶质细胞激活的指标;(2)显微镜下观察在注射miR-155后,血管周围聚集的小胶质细胞/吞噬细胞减少,提示miR-155抑制活化后小胶质细胞对血管的吞噬作用;(3)调控免疫细胞(小胶质细胞)表型转化：在miR-155抑制剂注射7 d后,M1表型标志物CD45与CD86的表达下降。而M2型激活因子：IL-10与CD-45的表达上调,IL-10可通过激活CD-45磷酸化,从而负向调控小胶质细胞的激活。因而miRNA-155能够调控小胶质细胞的分化及抗炎表型的极化。在此基础上,Wen Y等人[22]用100 mol/L的旋覆花内酯(acetylbritannilactone,ABL)处理BV2细胞后,可消除mi-155的增长。其机制为ABL通过抑制NF-κB、TLR4表达和促进MyD88、SOCS1及I-κB的表达,进而抑制CGD诱导的BV2细胞中炎症因子的表达。因而,靶向应用MiR-155可为抑制小胶质细胞的过度激活提供新策略。

2.2 负向调控小胶质细胞激活及促使M2型转化

2.2.1 miRNA203 髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)通过诱发转录因子NF-κB、AP-1核转位,增强宿主细胞对病原体的免疫应答。已研究证明[23]MyD88介导小胶质细胞的神经炎症。此外,miR-203在病理及生理免疫反应中也起到重要作用。Yanga等人[24]发现在OGD诱导活化的小胶质细胞中,MyD88可作为miR-23调控小胶质细胞释放炎症因子的重要靶点,直接调控MyD88转录水平的表达,减弱NF-κB、IL-1β等炎性因子的表达活性。过表达miR-203可减少神经炎症,改善神经元功能。这一发现为脑缺血损伤的治疗提供新靶点。

2.2.2 miR-93与miR-27a 白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK4)可增强小胶质细胞中NO和TNF-α的释放,介导炎症反应的发生。在体内或体外实验中[25],小胶质细胞中的miR-93水平与IRAK4的表达均呈负相关。ELISA结果显示,在脑缺血再灌注小鼠体内注射miR-93模拟物容易导致RAK4的蛋白表达量减少,IL-1、TNF-α的释放减少,抑制神经元凋亡。因此,miR-93可抑制脑缺血再灌注中炎症因子释放,抑制缺氧后小胶质细胞的表达。然而,关于IRAK4能否成为miR-93的直接靶点尚不确定。

随后Lv等[26]对miR-27a是否能够调控小胶质细胞介导的神经炎症进行研究,结果发现过表达miR-27a可显著降低小胶质细胞的炎性因子白介素-6 (IL-6)、白介素-1β (IL-1b)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和一氧化氮(NO)的表达,其机制为miR-27a可直接靶向结合到IRAK4、TLR4的3’非翻译区,抑制其表达。进一步佐证了IRAK4可作为miRNA对小胶质细胞激活影响的重要靶点的可能性。

2.2.3 miRNA-124 miRNA-124在小胶质细胞中特异性表达,对维持大脑小胶质细胞处于稳定状态具有重要作用。在缺血缺氧环境下,miR-124通过直接抑制转录因子CCAAT/增强结合蛋白-a(C/EBP-a)及其下游靶蛋白pu1,可诱导小胶质细胞从激活状态变为静止状态,减少神经炎性因子的释放。有研究显示[27]miRNA-124水平与小胶质细胞介导的神经炎症呈负相关,在脑缺血损伤大脑内早期注射miRNA-124可增加Arg-1表达,促进小胶质细胞M2型的转化、提高神经元存活率。且miRNA-124在脑缺血损伤中的表达作用具有区域和时间依赖性,早期注射及持续长时间注射能够将其神经保护作用发挥到最大。Hamzei等人[28]分别在促炎高峰期之前、之后给予miR-124注射,以此观察miRNA最佳治疗时间窗,其中miR-124在促炎高峰前注射能显著使激活的小胶质细胞向M2表型转化,与之前研究结果一致。此外,有研究发现D-4F[29]作为一种具有抗炎作用的载脂蛋白可通过增加体内、体外microRNA-124水平,促进1型糖尿病型脑缺血大鼠的神经功能恢复,其机制为miRNA-124可通过促进小胶质细胞M2型极化、降低基质金属蛋白酶-9、肿瘤坏死因子-1和toll样受体-4基因表达,改善神经功能与维持血脑屏障的完整性。因此,在缺血缺氧环境下,miRNA-124可通过结合多个靶点抑制神经炎症发生、减少神经元凋亡及降低血脑屏障的破坏。

2.2.4 miRNA-1906 在脑缺血损伤中TLR4的表达增多介导小胶质细胞的激活及炎症介质的释放(miRNA调控Toll 样受体4参与神经系统缺血缺氧性损伤的研究进展)。Xu XM等人[30]在体内、体外实验均发现小胶质细胞中TLR4的表达多伴随着神经细胞毒性的发生,不利于神经功能的恢复,当体内注射miR-1906激动剂后,TLR4的表达量受到抑制。应用microRNA图谱确定TLR4为miR-1906的靶向结合位点。此外,在TLR4基因敲除的小鼠中miR-1906的神经保护作用消失。提示miR-1906在脑缺血损伤中的保护作用依赖TLR4的表达。

2.2.5 miR-26b 先前已有研究表明OGD诱导下的BV2小胶质细胞中IL-6表达增多,miR-26b的表达下降,为进一步确定IL-6与miR-26b在脑缺血中的关系,Kang YC等人[31]运用荧光素酶实验以确定OGD-小胶质细胞与MCAO小鼠小胶质细胞中miR-26b的靶基因,结果表明miR-26b能够直接结合到IL-6的3’端的非翻译区,抑制其转录,减少大脑神经炎症与损伤。此外,miR-26b在介导小胶质细胞激活过程中,仍存在许多下游靶基因。进一步研究可为脑缺血治疗提供新靶点。

3 小结与展望

综上所述,miRNA作为一种可同时调控多种通路及蛋白的非编码RNA,可通过抑制小胶质细胞激活及M1表型极化,从而减少脑缺损伤中神经炎症及细胞凋亡的发生。但目前为止,miRNA相关抑制剂及模拟物还未在临床实践中开展,主要在于miRNA的给药途径多为侧脑室注射,不易被患者接受。我们应在现有基础上继续深入研究,以确保日后临床上安全及有效实施。由于小胶质细胞表型空间分布特征不够明确,miRNA的注射时间也有待进一步研究。此外,小胶质细胞的促炎与抗炎表型并非相互对立,探究miRNA维持小胶质细胞表型的稳定状态可能是未来研究方向。小胶质细胞和星形胶质细胞与周围环境关系密切,因此探究miRNA在多种小胶质细胞中相互作用机制,可为脑缺血损伤治疗提供新靶点。