沉默G6PD对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及其作用机制

陈朝梅 奚敏 施秀 王芳 周金华

作者单位：215024 苏州 苏州大学附属第一医院妇产科

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，因早期症状不明显，大多数患者确诊时已处于晚期，难以通过手术根治［1］。化疗是卵巢癌重要的治疗选择，大多数晚期患者可以从化疗中受益［2］。顺铂目前是治疗卵巢癌的一线治疗药物，能形成顺铂-DNA结合物，阻碍DNA复制，从而引起DNA损伤，最终诱导细胞死亡［3］。但是，70%～90%的晚期卵巢癌患者最终因铂类药物耐药复发死亡［4］。而且对顺铂耐药的患者通常对其他化疗药物无反应，预后极差。因此，阐明卵巢癌顺铂耐药机制并逆转其耐药性成为改善患者预后的关键。蛋白质组学技术是一种高通量的蛋白质分析技术，可用于识别差异表达的蛋白质，在了解肿瘤发病机制中发挥着重要作用［5-7］。尤其是基于离子强度的、无标记的定量蛋白质组学方法近年来越来越受欢迎，为从复杂的生物样本中分析和识别数千种蛋白质提供了一个强大的工具。本研究利用液相色谱质谱/质谱（LC-MS/MS）非标记（Label-free）定量蛋白质组学方法鉴定了人卵巢癌细胞中与顺铂耐药相关的蛋白葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD），并探讨其在卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用及其潜在的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

1.1.1 细胞系 人卵巢癌顺铂敏感细胞A2780由西交利物浦大学王牧教授赠予。A2780细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，取对数生长期的A2780细胞用于后续实验。

1.1.2 主要试剂 顺铂注射液购自齐鲁制药有限公司；胎牛血清、DMEM培养基以及消化细胞所用胰酶均购自美国HyClone公司；胰蛋白酶购自美国Promega公司；MTT粉剂、二甲基亚砜、lipid peroxidation（bodypy-c11荧光染料）均购自美国Sigma-Aldriich公司；BCA蛋白定量试剂盒、超敏化学发光试剂盒、ROS活性氧检测试剂盒（DCFH-DA，二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯）均购自上海碧云天生物技术公司；siRNAG6PD及其阴性对照（siRNA-NC）由上海吉玛生物科技有限公司设计合成；LipofectamineTM3000转染试剂购自美国Invitrogen公司；RNA提取试剂盒Trizol、反转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；G6PD、GAPDH基因引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成；抗体G6PD购自上海Abways生物科技有限公司；GAPDH、HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG均购自武汉ABclonal生物科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI双染试盒购自美国BD Bioscience公司；丙二醛（MDA）测定试剂盒、谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/CDDP的构建及转染

通过低浓度加量持续诱导法构建卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/CDDP。首先将对数生长期的亲代人卵巢癌顺铂敏感细胞A2780接种至6孔板中，用含0.5µg/mL顺铂的DMEM培养基培养2 d，PBS洗涤后更换为DMEM培养基继续培养；细胞稳定生长后以同浓度顺铂再次处理。2周后，顺铂逐渐增加至1µg/mL，继续培养2周；按照相同步骤，将顺铂浓度逐渐升至2µg/mL、4µg/mL、8µg/mL，直至细胞能在10µg/mL顺铂浓度中稳定生长并重复传代，即视为顺铂耐药细胞A2780/CDDP。

A2780/CDDP细胞用含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，培养基中同时添加2µg/mL顺铂以维持细胞对顺铂的耐药性。将A2780/CDDP细胞按1×105/孔接种于6孔板中，按照Lipofectamine 3000TM转染试剂说明书方法，分别转染siRNA-NC、siRNA-G6PD，并依次记为NC组和siG6PD组，转染24 h后更换为DMEM新鲜培养基，继续培养用于后续实验。

1.3 Label-free定量蛋白质组学法检测A2780和A2780/CDDP细胞中的耐药相关差异表达蛋白

A2780和A2780/CDDP细胞经8 M尿素超声裂解后，提取总蛋白，在56℃下用5 mmol/L二硫醚醇（DTT）处理30 min，室温下用11 mmol/L碘乙酰胺（IAA）在黑暗中烷基化15 min。根据BCA试剂盒说明书方法对裂解的上清液进行蛋白质估算。从所有细胞系中提取等量的蛋白质，用胰蛋白酶于37℃下消化12～14 h后，真空干燥并储存备用。

采用纳升流速Easy-nLC 1000色谱系统分离酶解后的肽段。A液为0.1%甲酸溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液。每个样品由自动进样器上样到捕集柱（nanoviper 15 cm，2µm magic C18），再经过分析柱［nanoviper 25 cm（75µm silica capillary，3µm magic C18）］分离，色谱柱以95%的A液平衡，流速为300 nL/min，5%～30%B液线性梯度洗脱120 min。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后，用LTQ Orbitrap Elite质谱仪（Thermofisher，USA）进行质谱分析，过柱时长120 min，离子化后均带一个单位正电荷；母离子扫描范围为300～2 000 m/z。质谱分析数据采用MaxQuant v1.6.7.0处理。根据UniProt数据库，比对每个肽段的MS谱，鉴定和定量相应的蛋白。蛋白鉴定和定量分析的置信度阈值设为＞99%，FDR（false discovery rate）＜1%。基于MaxQuant置信度评分进行蛋白鉴定。在随后的相对定量分析中，所有比率采用log2FC＞0.75或＜-0.75倍临界值（P＜0.05），以减少识别蛋白上调或下调时出现的假阳性率［8］。

1.4 卵巢癌耐药相关差异表达蛋白的功能富集分析

应用R语言（4.1.1版本）的clusterProfiler程序包对上调和下调的差异表达蛋白分别进行GO和KEGG功能富集分析，并通过ggplot2包绘制条形图。上调/下调差异表达基因的GO和KEGG富集分析结果均以FDR调整的P值＜0.05作为筛选标准。

1.5 RT-qPCR检测G6PD mRNA表达

用Trizol试剂提取A2780和A2780/CDDP细胞中的总RNA，NanoDrop 2000紫外分光光度计检测RNA的纯度、浓度，并通过逆转录试剂盒反转录成cDNA，再采用ChamQ Universal SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，以cDNA为模板进行RT-qPCR实验。扩增条件：95℃ 5 min、60℃ 30 s、72℃ 10 min，40个循环。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达水平。引物序列：G6PD上游引物为5'-AAGAGCTTTTCCAGGGCGAT-3'，下游引物为5'-CGATGAAGGTGTTTTCGGGC-3'；GAPDH上游引物为5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物为5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.6 Western blot检测G6PD蛋白表达

收集各组细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，提取总蛋白，按照BCA法检测蛋白浓度，然后上样、SDS-PAGE电泳分离、转膜、封闭，加入一抗G6PD（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000），4 ℃孵育过夜；加入鼠二抗和兔二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜后，利用超敏ECL底物在凝胶成像系统上显影，以GAPDH为内参分析G6PD蛋白的相对表达量。

1.7 MTT检测细胞的增殖能力

A2780、A2780/CDDP细胞以及转染后的NC组和siG6PD组细胞均以1 500/孔的密度接种于96孔板中，培养24 h后，各组细胞均加入不同浓度梯度的顺铂，其中加入A2780、A2780/CDDP细胞的顺铂浓度梯度依次为0µg/mL、3.13µg/mL、6.25µg/mL、12.50µg/mL、25.00µg/mL、50.00µg/mL，NC组和siG6PD组细胞依次为0µg/mL、3.75µg/mL、7.50µg/mL、15.00µg/mL、30.00µg/mL、60.00µg/mL，然后均继续培养48 h；之后加入15µL的5 mg/mL MTT溶液，继续孵育4 h后，弃掉培养基，每孔加入150µL二甲基亚砜，次日用酶标仪检测每孔在490 nm波长处的吸光度，以观察A2780、A2780/CDDP细胞的耐药情况以及沉默G6PD后细胞对顺铂的敏感性。

1.8 Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况

收集NC组和siG6PD组细胞，300 g离心5 min后，用100µL缓冲液重悬，然后按照AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒说明书的操作步骤，每个样品分别加入2.5µL FITC和2.5µL PI，孵育30 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。另通过前期预实验发现5µg/mL、10µg/mL、15µg/mL顺铂分别处理NC组和siG6PD组细胞后，5µg/mL和15µg/mL顺铂作用下两组细胞的凋亡率无明显差异，故选择10µg/mL顺铂处理转染后的细胞。用10µg/mL顺铂处理NC组和siG6PD组细胞24 h，并记为NC+CDDP组和siG6PD+CDDP组，收集细胞，然后按照上述步骤检测细胞凋亡情况。

1.9 铁死亡相关物质ROS、MDA、GSH和脂质过氧化物水平的检测

用10µg/mL顺铂分别干预A2780细胞、A2780/CDDP细胞以及NC组和siG6PD组细胞24 h后，各组约收集1×106个细胞于离心管中并用PBS缓冲液洗涤3次，收集沉淀，分别用 10µmol/L DCFH-DA、2.5µmol/L bodypy-c11荧光染料重悬细胞，并置于细胞培养箱内孵育30～40 min，用PBS缓冲液洗涤后，上流式细胞仪分别检测各组细胞内ROS和内脂质过氧化水平。另各收集每组细胞约1×106个，按照MDA测定试剂盒操作步骤测定MDA含量，结果以蛋白质含量归一化；再按照GSH检测试剂盒操作步骤测定GSH含量。

1.10 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组均数比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，采用Bonferroni检验进行多重比较。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/CDDP

MTT检测结果显示，不同浓度（3.13µg/mL、6.25 µg/mL、12.50 µg/mL、25.00 µg/mL、50.00 µg/mL）顺铂对A2780、A2780/CDDP细胞存活均有抑制作用，且细胞存活率随着顺铂药物浓度增加而逐渐下降，但在相同浓度顺铂的作用下，A2780/CDDP细胞存活率均明显高于A2780细胞（P=0.031、0.027、0.007、0.003、0.019）。A2780/CDDP细胞的IC50值也显著高于A2780细胞［（28.727±3.184）µg/mL vs（5.503±0.412）µg/mL，P=0.005］，说明卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/CDDP构建成功。见图1。

图1 不同浓度顺铂对A2780、A2780/CDDP细胞活性的影响Fig.1 Effects of different concentrations of cisplatin on the viability of A2780 and A2780/CDDP cells

2.2 卵巢癌耐药相关差异表达蛋白的鉴定及功能富集分析

从A2780、A2780/CDDP细胞中分别提取5份重复蛋白质样品进行Label-free LC/MS分析，结果共鉴定出1 515个蛋白，其中差异蛋白共197个。与A2780细胞相比，A2780/CDDP细胞中有95个上调蛋白和102个下调蛋白，上调蛋白中以G6PD表达差异最为显著。进一步利用GO功能注释分析和KEGG信号通路分析差异表达蛋白的主要功能及相关信号通路，结果显示上调蛋白（如G6PD、GCLM、STT3B等）和下调蛋白（如MIF、PDHA1等）大多富集在代谢通路，其功能主要与细胞氧化应激反应、核糖磷酸代谢途径相关，见图2。因此，后续实验选择细胞中重要的代谢相关蛋白G6PD进行研究。

图2 卵巢癌耐药相关差异表达蛋白的功能富集分析Fig.2 Functional enrichment analysis of differentially expressed proteins associated with drug resistance in ovarian cancer

2.3 G6PD在A2780/CDDP细胞中表达上调

RT-qPCR和Western blot检测结果显示，A2780/CDDP细胞中 G6PD mRNA（5.101±0.625 vs 1.002±0.087，P=0.010）和蛋白（3.403±0.198 vs 1.001±0.065，P=0.002）的相对表达量明显高于A2780细胞。见图3A～B。此外，不同浓度（2µg/mL、4µg/mL、6µg/mL、8µg/mL、10µg/mL）顺铂处理A2780细胞24 h后，各组细胞中G6PD蛋白的表达水平均高于对照组（P=0.006，＜0.001，0.002，0.005，0.008），且G6PD表达量随顺铂浓度的增加而上升。见图3C。

图3 G6PD在顺铂耐药细胞株A2780/CDDP中表达上调Fig.3 Expression of G6PD was up-regulated in cisplatin-resistant cell line A2780/CDDP

2.4 沉默G6PD可增强A2780/CDDP细胞对顺铂的敏感性

Western blot检测结果显示，与NC组相比，siG6PD组中G6PD蛋白表达量显著降低（0.251±0.045 vs 1.031±0.067，P=0.001），表明细胞转染成功。见图4A。

MTT检测结果显示，不同浓度（3.75µg/mL、7.50 µg/mL、15.00µg/mL、30.00µg/mL、60.00µg/mL）顺铂对NC和siG6PD组细胞存活均有抑制作用，且随着药物浓度增加，相应的细胞存活率逐渐下降；但在相同浓度顺铂作用下，siG6PD组细胞存活率均明显低于NC组（P=0.001，0.017，0.015，0.008，0.019）。siG6PD组的IC50值也显著低于NC组［（15.298±1.165）µg/mL vs（23.476±2.378）µg/mL，P=0.012］。见图4B。

流式细胞术检测结果显示，与NC组相比，siG6PD组的细胞凋亡率明显升高［（10.270±0.360）%vs（8.130±0.210）%，P=0.006］；进一步用10 µg/mL顺铂处理24 h后，siG6PD+CDDP组的细胞凋亡率高于NC+CDDP组［（13.650±0.580）%vs（10.660±0.410）%，P=0.008］。见图4C～D。

图4 沉默G6PD可增强A2780/CDDP细胞对顺铂的敏感性Fig.4 Silencing G6PD increased the sensitivity of A2780/CDDP cells to cisplatin

2.5 沉默G6PD增加A2780/CDDP细胞铁死亡水平

与A2780细胞相比，A2780/CDDP细胞铁死亡相关物质ROS、MDA和脂质过氧化物水平均降低（P=0.002，0.008，0.041），但GSH水平升高（P=0.001），见图5A～D；而沉默G6PD后，A2780/CDDP细胞中ROS、MDA和脂质过氧化物水平均较NC组升高（P=0.006，0.044，0.045），但GSH水平降低（P=0.007），见图5E～H。

图5 沉默G6PD增加A2780/CDDP细胞中的铁死亡水平Fig.5 Silencing G6PD evoked ferroptosis in A2780/CDDP cells

3 讨论

顺铂是治疗卵巢癌有效的化疗药物之一，铂类药物化疗的初始反应率高达80%，但在大多数晚期患者中，最终会因获得性耐药导致复发和死亡［9］。研究表明，卵巢癌在顺铂的反复作用下，通过改变耐药相关基因的表达，可使肿瘤细胞凋亡减少，DNA修复功能增强，细胞生长、分化和增殖加快，从而抵抗顺铂诱导的细胞凋亡并产生耐药［10］。卵巢癌顺铂耐药的发生机制涉及多种蛋白，但目前尚未完全阐明［11-12］。本研究通过Label-free定量蛋白质组学法鉴定卵巢癌敏感细胞A2780和耐药细胞A2780/CDDP中异常表达的蛋白，发现与A2780细胞相比，A2780/CDDP细胞中共有95个上调蛋白和102个下调蛋白，其中上调蛋白中以G6PD表达差异最为显著；信号通路分析结果显示这些差异蛋白主要富集在代谢通路中。提示卵巢癌顺铂耐药的发生机制与代谢相关。G6PD是所有细胞中重要的代谢相关蛋白之一，其作为磷酸戊糖途径的关键酶，可以产生NADPH以维持还原型GSH，而GSH可清除ROS以保护癌细胞免受氧化损伤。也有研究表明，细胞对化疗药物产生的耐药性与细胞内氧化还原平衡密切相关［13］。由此推测，G6PD可能与卵巢癌顺铂耐药有关。为此，本研究通过siRNA技术构建卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/CDDP，并检测G6PD在细胞中的表达情况，结果发现G6PD mRNA和蛋白表达在A2780/CDDP细胞中明显升高，与蛋白质组学鉴定结果相符。进一步用不同浓度顺铂处理A2780细胞后发现G6PD表达量随着顺铂浓度的增加而上升，但在沉默G6PD后的A2780/CDDP细胞中发现细胞存活率及顺铂的IC50值均明显降低，而细胞凋亡率明显升高，说明G6PD上调可诱导卵巢癌顺铂耐药，而沉默G6PD可增强卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性。这一现象在紫杉醇耐药的卵巢癌细胞中也被观察到，表现为抑制G6PD表达可逆转对紫杉醇的耐药性［14］。

铁死亡是一种新的细胞死亡形式，其特征是铁依赖的脂质过氧化［15］。ROS和MDA是特异的脂质过氧化产物，也被视为铁死亡标志物。既往研究显示，细胞中的ROS、MDA、脂质过氧化物以及GSH含量可以反映细胞中的铁死亡水平，其中ROS、MDA、脂质过氧化物是氧化性物质，与铁死亡水平呈正相关，而GSH是还原性物质，与铁死亡的水平呈负相关［16］。铁死亡一般在特定的病理状态下被激活，其失调与神经退行性变、肾功能衰竭和肺损伤等多种生理和病理过程有关［17-18］。诱导铁死亡也可能有助于发现新的癌症治疗策略［19］，尤其在逆转肿瘤化疗耐药中表现出巨大的潜力，目前已发现顺铂耐药的胃癌细胞、骨肉瘤细胞都表现为更低的铁死亡水平［16，20］。在顺铂处理的非小细胞肺癌细胞中也发现，下调G6PD能有效诱导细胞凋亡和ROS积累［21］。同样，高表达的HMGA1激活G6PD转录后，可促进磷酸戊糖途径，提供NADPH和dNTP以对抗顺铂诱导的ROS和DNA损伤［22］。近期也有研究发现G6PD在肝癌中高表达且可抑制肝癌细胞中的铁死亡水平并促进细胞增殖、迁移和侵袭［23］。为进一步探索铁死亡与卵巢癌顺铂耐药的关系，本研究在A2780/CDDP细胞中检测铁死亡相关物质的水平，结果该耐药细胞也表现出较低水平的ROS、MDA和脂质过氧化以及较高水平的GSH，说明卵巢癌顺铂耐药细胞中存在较低的铁死亡水平；但是沉默G6PD后，A2780/CDDP细胞表现为ROS、MDA和脂质过氧化物水平升高，GSH水平降低，说明沉默G6PD表达可增加A2780/CDDP细胞中的铁死亡水平。

综上所述，G6PD在卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/CDDP中表达上调，沉默G6PD可能通过增加耐药细胞中铁死亡水平从而增强细胞对顺铂的敏感性，这一结果为逆转卵巢癌耐药提供了新的思路。同时，信号通路分析结果显示这些差异蛋白主要富集在代谢通路中，因此靶向铁代谢可能是逆转卵巢癌治疗耐药性的新治疗策略。但本研究仅在细胞层面进行探索，G6PD确切的作用及其具体的作用机制仍有待进一步验证。