脑缺血再灌注损伤涉及的信号通路研究进展

章霞 陈冰 李敏 张宇燕 陈伟燕

脑血管疾病具有发病率、复发率、致残率、病死率均较高，并发症多，即“四高一多”的特点[1]，其中缺血性脑血管病约占60%～80%，且发病率逐年升高，发病年龄趋于年轻化[2]。及时恢复脑组织缺血区血液供应是缺血性脑血管病治疗的有效方法[3]，但在再灌注恢复供血的同时易出现血脑屏障破坏、脑水肿、脑出血、神经功能损害及细胞凋亡等病理现象[4]，容易进一步加重脑组织损伤。脑缺血再灌注损伤涉及的信号通路十分广泛，如磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase,Akt）信号通路、NF-κB 信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路、Notch信号通路及Janus激酶信号转导子与转录激活子（Janus kinase signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT）信号通路等。本文对目前研究关注较多的信号通路作一综述。

1 PI3K/Akt信号通路

PI3K/Akt信号通路与脑缺血再灌注损伤后神经细胞的凋亡密切相关。PI3K广泛存在于细胞中，可因抑癌蛋白缺失或胰岛素等刺激激活，特异性催化使磷脂酰肌醇3位磷酸化，产生具有第二信使作用的磷酸肌醇。Akt又称蛋白激酶B，不仅是PI3K/Akt通路的中心环节，也是其直接靶点和主要靶酶，主要传导PI3K始动的生物信息。Akt通过下游靶点如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-9、NF-κB、叉头框蛋白、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、前列腺凋亡响应基因-4等调节细胞生存与代谢[5]。PI3K/Akt信号通路的作用机制是细胞外刺激激活PI3K，PI3K通过磷酸化Thr308和Ser473位点，直接或间接激活Akt形成磷酸化Akt（phosphorylated,p-Akt）。p-Akt通过增加一氧化氮合酶生成、抑制下游凋亡Caspase-9等的表达、抑制线粒体释放细胞色素C及凋亡因子、活化转录因子NF-κB、抑制糖原合成酶激酶-3的活性等，调节细胞代谢、增殖、凋亡及迁移等过程[6]。

PI3K/Akt信号通路是粒细胞、巨噬细胞刺激因子激活后，作用最强的抗凋亡途径[7]，也是脑缺血再灌注损伤后引起细胞凋亡、氧化应激等过程的重要信号通路[8]。再灌注后3～12 h，半影区Akt表达显著增强，而损伤中心脑区Akt活性较低[9]。研究表明海马神经元细胞中Akt的激活呈现出先降后升再降的双向变化趋势，缺血24 h海马神经元Akt磷酸化水平达到最高，缺血36～48 h后细胞色素C和Caspase-3表达升至最高，表明PI3K/Akt信号通路可能参与调控了脑缺血后的细胞凋亡[9]。研究通过建立局灶性脑缺血再灌注损伤的模型，发现与异丙酚组比较，异丙酚+PI3K特异性抑制剂组的大鼠行为学评分、脑梗死体积及细胞凋亡率均明显增加，B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）蛋白表达量均明显减少，这提示异丙酚对缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用可能与PI3K/AKT信号通路有关[10]。

PI3K/Akt通路在炎症反应的发生、发展过程中也发挥着重要作用。PI3K/Akt信号通路中的下游信号分子内皮型氧化氮合酶通过“精氨酸-内皮型氧化氮合酶-瓜氨酸”途径合成一氧化氮（nitric oxide,NO），NO可直接抑制炎性细胞因子生成，具有抗炎作用[11]。侯玮琛[12]研究发现没食子酰芍药苷能通过激活核转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）从而具有抗炎作用，且Nrf2的转录活性受PI3K/Akt调节，使用PI3K特异性抑制剂Ly294002对PC12细胞进行预处理后，发现该抑制剂能抑制没食子酰芍药苷的促Nrf2转核能力，并且还会抑制没食子酰芍药苷对炎症因子TNF-α和IL-1β的影响，削弱对细胞活性和凋亡的保护作用。由此可见，PI3K/Akt信号通路在脑缺血再灌注损伤后抗凋亡和抗炎方面发挥了重要作用。

2 NF-κB信号通路

NF-κB是Rel蛋白家族的组成部分[13]，主要分布在神经细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中，参与调控多种炎症基因的转录[14]，是脑缺血后炎性级联反应的始动因素，参与脑缺血再灌注损伤的发生和发展[15]。NF-κB常以二聚体形式存在，尤以p65/p50异二聚体最为常见，也是其发挥生物学活性的主要形式。NF-κB信号通路未激活时，p65/p50二聚体与其抑制蛋白ⅠκB家族结合成失活状态存在于细胞质中，无法发挥其生物学作用。病理状态下，ⅠκB的上游激酶磷酸化使得IκB降解，NF-κB与ⅠκB解离后可与细胞核内DNA特定靶点结合，启动相关靶基因转录，参与调节细胞因子表达、免疫反应及炎症反应等[16]。激活后的NF-κB可使抑制因子ⅠκB转录水平上调，构成负反馈调节，抑制炎症介质的生成。而炎性细胞因子如IL-1、IL-2、TNF-α，黏附分子如血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1，以及转化生长因子-β等又可诱导NF-κB进一步活化，形成正反馈调节，加重炎症反应[17]。

研究证实，NF-κB信号通路可通过促进炎症反应、自由基损伤和细胞凋亡，在脑缺血再灌注损伤过程中发挥重要的调控作用[16，18]。脑缺血再灌注损伤后，血管内皮细胞产生大量自由基及TNF-α、IL-1、血小板激活因子等诱导NF-κB表达，NF-κB激活使得血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1等黏附分子及炎症因子的基因表达增多[19]，而上述因子直接或间接影响内皮细胞，激活趋化因子，启动下游激酶级联反应[20]。缺血再灌注时，机体也可产生超氧化物歧化酶等因子，阻断NF-κB信号通路，起到脑保护作用。大量研究证明，皂苷类、黄酮类、酚类和生物碱等中药活性成分对脑缺血再灌注损伤模型大鼠具有较好的脑保护作用[21]，其脑保护作用机制可能与抑制缺血后NF-κB信号通路的激活有关。脑缺血再灌注诱导了脑和PC12细胞ⅠκB磷酸化和NF-κB p65的核翻译，而红花黄色素B能显著降低NF-κB p65的核翻译，同时降低ⅠκB磷酸化，表明其抗炎作用可能是通过抑制NF-κB途径实现的。研究表明脑心通胶囊治疗后脑梗死有所好转，脑梗死体积减少，提示脑心通胶囊可能通过降低TNF-α、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-9表达量从而减轻脑损伤，与此同时，NF-κB表达量也相应降低，提示脑心通治疗脑缺血的机制可能是通过NF-κB信号通路调节NF-κB表达量,进一步调节炎症反应，减少再灌注损伤，改善梗死后脑水肿，保护脑组织[22]。除此之外，采用针刺治疗能显著降低血清及缺血脑组织IL-1β、IL-6和IL-8含量，降低NF-κB p 65蛋白表达，从而有效调节急性脑缺血大鼠炎性损伤[23]。

NF-κB信号通路还与脑缺血再灌注损伤后引起的细胞凋亡密切相关。雷公藤内酯醇对急性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能缺损评分明显改善，神经细胞凋亡减少，脑梗死体积减小，与此同时，NF-κB p65和NF-κB活性的表达被抑制[24]，提示NF-κB通路激活可能与细胞凋亡有关。在脑缺血再灌注损伤中，NF-κB信号通路的作用机制主要是促进炎症反应、诱导细胞凋亡和介导自由基损伤，3条途径相互作用、相互影响，加重了脑损伤程度。研究也表明，NF-κB的活化具有双向性，活化过度加重脑缺血损伤，表达不完全则不利于保护脑组织[18]。因此，如何适度干预NF-κB的活化以减轻脑缺血再灌注损伤，已成为今后研究的热点和重点。

3 MAPK信号通路

MAPK信号通路是真核细胞内重要的信号传导系统，是联系细胞质和细胞核的枢纽。MAPK信号通路的激活是一个三级酶促级联反应，MAPK激酶磷酸化后激活MAPK，将细胞外刺激信号转导至细胞内部，调控细胞增殖、分化、凋亡等过程[25]。MAPK信号通路包括细胞外调节蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase,ERK）通路、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）/应激活化蛋白激酶（stress activate dprotein kinase,SAPK）通路、p38通路和ERK5通路4条途径[26]。目前上述信号通路活性表达强弱对脑缺血再灌注损伤的影响已成为研究的热点。

丝裂原活化蛋白激酶（methyl ethyl ketone,MEK）/ERK通路被生长因子、细胞因子、G蛋白偶联受体配体、渗透压等刺激后，按神经生长因子（nerve growth factor,NGF）-大鼠肉瘤蛋白（rat sarcoma protein,RAS）-加速纤维肉瘤激酶（rapidly accelerated fibrosarcoma,RAF）-MEK顺序激活，激活后的ERK1/2通过核转位进入细胞核，进一步激活其下游相关的转录因子和胞质/胞核激酶有丝裂原激活的蛋白激酶作用激酶（MAP kinase-interacting kinase,MNKs）、核糖体 S6蛋白激酶（ribosomal S6 kinase,RSK）、丝裂原和应激激活蛋白激酶（mitogen-and stress-activated protein kinases,MSKs）等，从而调控细胞的生长、增殖和分化[27]。ERK/MAPK通路参与调控脑缺血再灌注损伤后神经细胞的凋亡，当神经元缺血缺氧时，神经元细胞会发生自噬和凋亡。Beretta等[28]应用MEK-ERK1/2和ERK1/2 MAPK阻滞剂、p38 MAPK阻滞剂研究七氟醚对脑缺血再灌注损伤的保护机制，提出MEKERK1/2和ERK1/2 MAPK是保证细胞外信号传导至胞内的重要信号通路。姜云耀等[29]通过网络药理学方法，经通路富集分析后，明确益气通络颗粒保护脑缺血再灌注损伤靶基因比较集中的3条信号通路为环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）、PI3K/Akt和ERK/MAPK，同时研究还发现，给药组与模型组比较，cAMP含量显著上升，PKA、p-环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）、p-Akt和 p-丙酮酸磷酸双激酶（pyruvate orthophosphate dikinase,PPDK） 表达增加，p-JNK、p-p38和p-ERK表达下降，表明益气通络颗粒通过调控cAMP、PI3K-Akt和ERK/MAPK信号通路发挥了对脑缺血再灌注损伤的保护作用。亚低温疗法也可改善大鼠缺血后神经功能缺损，减少梗死面积及细胞凋亡，显示其对脑组织的保护作用可能与通过MAPK/ERK通路降低磷酸化MEK-2、ERK1/2蛋白的表达水平有关[30]。

p38 MAPK是MAPK家族的重要成员，在应激条件下被激活，既参与调控细胞生长、损伤、凋亡和炎症反应等过程，又介导神经元的生长和凋亡[31]，被称为细胞信号转导的中转站。p38信号通路可被炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1、表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）/转化生长因子（transforming growth factor-β,TGF-β）或紫外线等刺激激活[32]，调控细胞凋亡、细胞因子产生及调节转录。研究显示p38 MAPK信号通路可能通过以下环节参与细胞凋亡[33]：（1）使c-myc基因表达增强；（2）促进 p53磷酸化；（3）激活 cfos基因和c-jun基因；（4）相关凋亡因子/相关凋亡因子配体（factor associated suicide/factor associated suicide ligand,Fas/FasL）介导调亡；（5）增强 Bax 转位；（6）增强表达TNF-α。p38 MAPK能够增强TNF-α表达水平，促进p38 MAPK活化，诱导细胞凋亡。Legos等[34]在脑缺血小鼠造模前1 h及造模后6 h，给予不同口服剂量的 SB239063（p38 MAPK抑制剂），24 h后检测脑梗死体积及神经元缺损情况，结果显示口服SB239063可明显减少脑梗死体积，降低神经元缺损。p-p38 MAPK在大鼠脑中动脉缺血组、电针预处理组均较正常组明显上调[35]，提示p38 MAPK通路参与了大脑中动脉闭塞的发生，而且电针预处理组p-p38 MAPK/p38 MAPK明显低于大鼠脑中动脉缺血组，表明抑制p38 MAPK磷酸化可能是电针预处理干预大脑中动脉闭塞的重要机制之一。因此p38 MAPK信号通路可能成为治疗脑缺血再灌注损伤的作用新靶点。

4 Notch信号通路

Notch 信号通路由 4 种受体（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）、5 种配体（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2）及下游效应物组成，可调控细胞增殖、分化、凋亡、迁移及黏附等生长发育[36]。缺氧时，缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor,HIF-1α）激活，诱导血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）等表达，DLL4等Notch配体表达增多，其胞外段与细胞表面的Notch受体胞外段结合，激活Notch受体，在去整合素金属蛋白酶的作用下，Notch受体胞内段裂解并迁移入核，并与MAML蛋白转录因子结合，启动下游靶基因Hes1、Hes7等的转录。

脑缺血后，Notch信号通路在神经细胞凋亡、炎症反应及缺血区血管生成等方面均能发挥较好的调控作用。脑缺血后，Notch受体胞内段表达增多，激活JNK/c-Jun信号通路促进细胞凋亡级联反应[37]，抑制Notch信号通路可抑制神经细胞凋亡，保护神经功能免受侵害[38]。Zhao等[39]建立小鼠全脑缺血再灌注损伤模型，发现经鸢尾素预处理后，IL-1β和TNF-α的表达降低，海马神经元的凋亡减少，表明鸢尾素可能抑制脑缺血损伤后的炎症，减少神经元凋亡，同时鸢尾素还能上调Notch1、Notch胞内段和Hes-1的表达，表明鸢尾素可通过激活Notch信号通路减轻脑缺血再灌注损伤后的神经损伤。Notch信号在小胶质细胞中表达，对小胶质细胞的成熟和活化具有促进作用，并可促进脑缺血再灌注损伤后炎症反应的发生[40]。刘波[41]对脑中动脉缺血大鼠进行DAPT（一种γ-泌肽酶特异性抑制剂）治疗，发现Notch信号通路在大鼠缺血性脑损伤过程中被激活，活性明显上调，而DAPT可减少 Notch-1、Jagged-1、Hes-1 的表达，也可减少 IκB 激酶、NF-κB的表达，表明Notch信号通路可通过NF-κB参与炎症反应，介导脑缺血再灌注损伤。Notch信号通路在内皮细胞分化为顶端细胞和柄细胞的过程中发挥了重要的调节作用。脑缺血发生后，HIF-1α被激活，可促进VEGF表达，VEGF配体与受体结合激活Notch信号通路，上调DLL4的表达，启动下游靶基因Hey、Hes转录。

5 JAK/STAT信号通路

JAK/STAT信号通路是多种细胞因子在细胞内传递信号的共同途径，主要参与调节细胞增殖、分化、存活、凋亡等过程[42]。大量研究表明，JAK/STAT信号通路在脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的过程中起着重要的调节作用，其中JAK2-STAT3关系最为密切。脑缺血后JAK2-STAT3过度活化，JAK2-STAT3信号通路异常激活，加速了神经元细胞的凋亡，导致脑损伤加重。魏小于等[43]研究发现白及多糖治疗脑缺血再灌注损伤大鼠可抑制JAK2-STAT3信号通路异常活化，抑制细胞凋亡、炎症反应，从而保护缺血后神经细胞，阻断脑损伤的加重。

目前，脑缺血再灌注损伤后神经元细胞的存活、死亡与JAK/STAT信号通路的具体关系尚不明确。因此，深入探讨JAK/STAT信号通路在调控脑缺血再灌注损伤中神经元凋亡的作用机制，分析JAK/STAT信号通路与其他信号通路之间的相互作用，将为防治脑缺血再灌注损伤提供更有效的思路，并为寻求治疗新靶点提供可靠的参考依据。

6 其他脑缺血再灌注损伤过程中的信号通路

参与脑缺血再灌注损伤的信号通路还有很多，例如水通道蛋白4、内质网应激、MMP、死亡受体通路、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotidebinding oligomeric domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎性复合体通路、低氧诱导因子（hypoxia inducible factor,HIF）等。缺血再灌注后出现的脑水肿与MMP关系密切，褪黑素可减少MMP-9表达以保护血脑屏障的毛细血管基膜完整性[44]，维持颅内外渗透压平衡，减少脑水肿的发生[45]；MMP-2和MMP-9可激活lL-8等多种促炎因子、消化Ⅳ型胶原蛋白和紧密连接蛋白及破坏颅内外渗透性平衡，促进脑水肿的发生[46]。同时，MMP-2和MMP-9在再灌注损伤中发挥的作用也不尽相同，MMP-9参与早期脑缺血再灌注损伤后脑水肿的形成及再灌注损伤[47]，而MMP-2主要负责后期修复组织及清除坏死组织等。研究表明，川芎、黄芪有效成分配伍可有效抑制缺氧诱导的脑微血管内皮细胞发生G1/S期阻滞，减少细胞的凋亡，减弱细胞中Caspase-3和Caspase-8基因表达，而Caspase-8是死亡受体通路的关键启动因子，活化后的Caspase-8可引发Caspase蛋白酶解级联反应，并进一步链式水解激活其下游的Caspase-6、Caspase-7等同源酶，最后激活其效应物Caspase-3发生生物效应。以上均说明川芎、黄芪有效成分对内皮细胞的保护作用可能与抑制死亡受体通路有关。

7 小结

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的损伤过程，以神经细胞凋亡为主要因素，线粒体功能障碍与炎症反应为关键环节，氧化应激、兴奋氨基酸过度释放等为重要诱发因素，钙离子超载、血脑屏障破坏、酸中毒以及脑水肿等为继发性损伤，共同促进脑缺血损伤的恶化。脑缺血再灌注损伤涉及的信号通路相当广泛，且各信号通路间互相影响、相互交叉成网络，如脑缺血后Notch通路和NF-κB信号通路相互交叉影响，促进炎症因子表达[48]；NLRP3信号通路亦可通过激活NF-κB通路上调IL-1β前体表达，进一步增强NLRP3炎性体的作用[49]。而这些作用机制与各信号通路之间的相互作用或关系尚不明确，有待于进一步深入研究。

目前临床常采用中西医联合用药的方式治疗脑缺血再灌注损伤，利用中药多组分、多途径、多靶点综合作用的特点，通过抑制细胞凋亡、抑制炎症反应、减少自由基产生等多种途径联合防治缺血再灌注损伤。但是，联合不同信号通路共同预防和治疗脑缺血再灌注损伤的措施因实施的时间点、交汇点及组合方式均不明确，需要进一步深入开展各信号通路之间的相互作用及作用机制的研究。