检测循环细胞游离DNA用于淋巴瘤诊断和评估的研究进展

白小腾，孙晓红，赵翔宇，李子坚

(1.兰州大学 第一临床医学院， 甘肃 兰州 730030； 2.兰州大学第一医院 血液内科， 甘肃 兰州 730000)

淋巴瘤(lymphoma)是一类起源于淋巴系统的恶性肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma, NHL)。目前诊断淋巴瘤和评估肿瘤生物学特征仍然主要依赖于病变组织的组织病理活检。化学治疗前的疾病分期以及治疗后的疾病评估主要依赖影像学检查，如超声、X线计算机体层成像(computed tomography, CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)及正电子发射计算机断层扫描(positron emission tomography/computed tomography, PET/CT)等。组织病理活检有些情况下面临着取材困难的问题，而影像学评估始终面临敏感性不足和对肿瘤负荷精确定量比较的难题。另一方面PHOENIX[1]和RUBUST[2]研究的Ⅲ期临床研究的失败，提示目前基于细胞起源的病理分型不能准确指导靶向药物的治疗，需要根据基因分型及相关的信号通路异常来指导各种分子靶向药物在淋巴瘤治疗中的应用。

近年来，循环细胞游离DNA(circulating cell-free DNA, cf DNA)或循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)的分析，也称为液体活检逐渐受到重视。在21世纪精准医疗的时代背景下，cf DNA检测凭借其可对肿瘤进行无创、实时、全面的动态监测，同时还能够克服传统淋巴组织活检取材困难的局限性等优势，迅速成为近年来研究的热点，在肿瘤的早期诊断、预后判断以及治疗后监测方面具有较高的临床价值，尤其随着新一代测序技术的发展成熟和成本大幅度下降，其在经济成本方面的劣势明显减小。因此，基于二代基因测序(next-generation sequencing, NGS)技术对淋巴瘤cf DNA的检测和动态监测，对于淋巴瘤的诊断、基因分型、动态监测、治疗后评估、预后判断具有越来越明显的技术和经济优势。

1 cf DNA与ct DNA

Cf DNA，又称无细胞DNA，属于小片段双链DNA, 这些DNA片段非常短[<200个碱基对(bp)],可存在于人的循环血清、血浆、尿液和其他体液中，由凋亡和坏死细胞释放，在健康人群，正常器官组织来源的cf DNA中，淋巴样细胞和髓样细胞的脱落DNA所占比例最大[3]。血液中循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ct DNA)是cf DNA的一部分，来源于坏死或凋亡的肿瘤细胞或吞噬坏死肿瘤细胞的巨噬细胞，仅占外周血cf DNA总量的一小部分(有时<0.01%)[4]。cf DNA在健康人血清中的含量为0～100 ng/mL, 平均为30 ng/mL, 而在肿瘤患者血清中, 血清游离DNA的含量个体之间的差异比较大, 在0～1 000 ng/mL, 平均约为180 ng/mL[4]。因此通过对血液cf DNA的含量的检测，对肿瘤早期诊断和治疗后监测具有显著的价值。

2 淋巴瘤与cf DNA的关系

健康人血液中cf DNA浓度较低，而淋巴瘤患者体内的cf DNA浓度明显增加，分子生物学的研究证实，淋巴瘤患者血浆 cf DNA 具有肿瘤相关遗传学改变，如微卫星改变， IgH 和TCRγ基因重排，与淋瘤组织DNA具有相同的临床意义[5]。相关研究表明，淋巴瘤患者血液cf DNA水平(约为健康人7倍)和淋巴结炎患者 DNA 水平(约为健康人2倍)与健康志愿者相比有差异。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)明显增高的淋巴瘤患者血液cf DNA水平明显高于LDH正常的患者，此研究提示血液cf DNA水平反映疾病增殖活跃[6]。在初治淋巴瘤患者、治疗期患者和健康人体内cf DNA水平的比较中，淋巴瘤患者初始阶段的cf DNA浓度和完整性显著高于治疗阶段的cf DNA浓度和完整性，并且治疗期的cf DNA浓度显著高于健康对照组的cf DNA浓度。但是，与健康对照组相比，治疗阶段的cf DNA完整性没有显著差异[7]。

原发性中枢神经系统淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma, PCNSL)占非霍奇金淋巴瘤的2%～3%和中枢神经系统恶性肿瘤的4%[8]。在25名PCNSL患者中，通过下一代基因测序(NGS)检测PCNSL患者脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)ct DNA和肿瘤组织中相关肿瘤突变基因，检测到基因突变匹配率分别为：MYD88 (80%)、PIM1(32%)、CD79B(28%)[9-10]。对6名疑似CNSL患者的肿瘤组织进行了NGS检测，同时和组织病理活检诊断进行了对比，使用NGS检测的特异性和敏感度均为100%，此研究还使用数字PCR对CSF和血浆中ct DNA进行了基因分析，CSF中cf DNA浓度明显高于相应的血浆样品，同时指出，CSF中的cf DNA几乎都来源于肿瘤细胞[10]。通过对脑脊液ct DNA的基因测序检测，可以克服原发性中枢神经系统淋巴瘤肿瘤组织取材困难的问题，对肿瘤进行基因分型，可以针对相应的基因进行靶向治疗，同时还可以进行微小残留的监测来识别疾病复发和指导患者预后评估。

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是最常见的侵袭性的非霍奇金淋巴瘤之一。基于NGS方法将16例DLBCL患者的血浆cf DNA和肿瘤组织进行基因分析，对比发现，cf DNA与肿瘤组织突变的等位基因的一致性为87.5%，表明cf DNA可以在大部分患者中代替传统组织活检标本用于基因分析[11]。通过免疫球蛋白基因的高通量测序(high-throughput sequencing of immunoglobulin genes Ig-HTS)方法对75例DLBCL患者的311份血浆ct DNA样本进行基因检测，与PET-CT相比，ct DNA测序检测的特异性更高(100%比56%)，但敏感性相似[12]。根据对DLBCL患者的免疫球蛋白受体基因重排的分析，与没有检测到ct DNA的患者相比，在监测期间ct DNA阳性的患者临床进展风险显著增高。此外，ct DNA监测方法具有较高的阳性预测率(PPV 88%)和阴性预测率(NPV 98%)[13]。15例经治疗后血浆中可检测到ct DNA的DLBCL患者的无进展生存期(progress-free survival, PFS)比10例检测不到ct DNA患者的PFS显著缩短[14]。还可以通过ct DNA分析以区分惰性淋巴瘤的惰性状态与组织学转化(histological transformation, HT)。组织学转化是惰性淋巴瘤转化为侵袭性淋巴瘤。比较组织学转化的滤泡细胞淋巴瘤(tFL)和滤泡细胞淋巴瘤(FL)之间的cf DNA基因组特征，发现tFL中单核苷酸变异的比例更高，ct DNA的含量也更高。尽管在进一步的研究中应验证ct DNA分析的效用，但本研究中计算出的PPV(91%)和NPV(80%)提示其能够区分tFL和FL[14]。基于NGS对79例DLBCL患者的血清cf DNA分析发现87%的患者可以检测到至少一种肿瘤相关基因突变，cf DNA检测突变的敏感性为68%，在cf DNA样本中发现的基因突变与组织样本高度一致，并在43%的病例中可用于肿瘤的遗传分类。另外，ct DNA水平与肿瘤负荷相关的临床参数(乳酸脱氢酶和β2-微球蛋白血清水平、分期和国际预后指数)和PET-CT评估的肿瘤总代谢体积显著相关。在接受治愈性治疗的患者中，高ct DNA水平(>2.5 log hGE/mL)与较低的完全缓解(65%比96%)、更短的无进展生存期(65%比85%)和较低的2年总生存期(73%比100%)相关[15]。基于NGS对8例接受嵌合抗原受体T(CAR-T) 细胞治疗后的难治或复发(r/r)DLBCL患者的血清及肿瘤组织样本进行了肿瘤相关基因分析，发现9份组织样本的DNA测序与同一时间点血浆中的ct DNA结果基本一致，ct DNA检测肿瘤相关基因突变的敏感性和特异性分别为94.7%和83.3%，保持长期完全缓解的患者与复发或对CAR-T治疗无效的患者相比，其血浆ct DNA突变的中位数分别为3和14.3。在连续41个月的中位随访中发现，cf DNA监测的趋势与PET-CT一致，且与携带≥8个血清ct DNA突变的患者相比，携带<8个突变的患者生存期更长。因此，ct DNA有望代替PET-CT在治疗后用于DLBCL微小残留的监测，同时ct DNA测序的便利性还可以在PET-CT检查间期实现多点监测，进一步促进DLBCL的精确治疗[16]。基于NGS或PCR等技术通过对非霍奇金淋巴瘤患者外周血cf DNA的分析，在治疗前用于识别基因克隆类型及肿瘤负荷的定量；治疗中用于判断疗效反应的预后；治疗结束后可以用于识别肿瘤清除率及预判整体生存和复发率；对于完全缓解的患者用于识别疾病复发[17]。当然，在cf DNA检测过程中受肿瘤自身特性、实验条件及标本等各方面因素的影响，也存在假阴性和假阳性的概率，因此还需大量的临床数据，根据不同肿瘤制定相应的可信区间，为淋巴瘤的标准化诊疗提供新的更有效的检测方法。

霍奇金淋巴瘤主要发生于青年人，老年人少见。多数来源于生发中心B细胞。经典型霍奇金淋巴瘤占所有霍奇金淋巴瘤的95%。其中儿童霍奇金淋巴瘤占儿童恶性肿瘤的5%[18]。对于HL，cf DNA分析使用了NGS和数字聚合酶链反应(digital polymerase chain reaction, dPCR)，NGS用于监测淋巴瘤免疫球蛋白基因突变区段，数字PCR用于XPO1热点突变的分析，研究表明霍奇金淋巴瘤的镜影(Reed-Sternberg, RS)细胞所产生的ct DNA也可以在血浆中检测到[19]。在此基础上进一步研究了霍奇金淋巴瘤ct DNA的基因分型，使用混合捕获靶向下一代测序的方法对霍奇金淋巴瘤患者cf DNA进行基因测序，检测到RS细胞产生的ct DNA单核苷酸变异、插入/删除、易位和 VH-DH-JH重排，在96例患者中，有72例患者在治疗前可监测到外周血cf DNA的突变，每个患者的基因变异数从1到21不等，带等位基因频率从0.6%到42%，突变基因中检测到9个易位断裂点，其中涉及JAK/STAT、NF-κB、PI3K信号传导和抗原表达的基因最常受到影响，VH-DH-JH重排分析揭示了RS细胞大部分来源于生发中心B细胞[20]。同时在对49例正在接受化疗的HL患者的研究中，43例ct DNA检测阴性的患者，其正电子发射断层扫描(FDG-PET)的评估也为阴性结果，在正电子发射断层扫描显示疾病持续存在的6例患者中，有5例患者ct DNA也为阳性。HL患者化疗期间ct DNA的消失与FDG-PET阴性和患者长期无进展生存密切相关[20]。同样，在34例经典霍奇金淋巴瘤患者cf DNA的下降水平与PET/CT扫描肿瘤体积缩小范围成正比[21]。因此cf DNA可能代替PET-CT用于治疗期间疾病的评估及肿瘤负荷的测量，同时也可以代替组织活检用于基因分析，进一步指导靶向药物的选择和研发。

3 淋巴瘤ct DNA的检测方法

3.1 免疫球蛋白VDJ基因测序(variable-diversity-joining rearrangements sequencing, VDJ-seq)

每个B细胞来源的淋巴瘤细胞都携带了一个单一型的免疫球蛋白VDJ基因，该克隆型重排可以作为一个“条形码”样的标志，通过简单的外周血样迅速检测以及时发现疾病是否复发。VDJ基因克隆型高通量测序技术(VDJ-seq)可以较大范围预测弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的复发，甚至比常规影像学所确定的复发早数个月[12-13]。此外，VDJ-seq在诊断中可以揭示肿瘤活检和血浆样本之间克隆的差异性，血cf DNA高水平状态似乎是一个可以定义高风险滤泡细胞淋巴瘤的强有力的因素[13, 22]。当然，VDJ基因重排检测也具有很大不足，如对于免疫球蛋白阴性表型的原发纵隔B细胞淋巴瘤，以及一些具有无效VDJ基因重排的DLBCL中无法检测，同时该技术也不适合用于确定靶向治疗的靶点以及监测治疗过程中抗性克隆的出现[23]。

3.2 二代基因测序(next-generation sequencing, NGS)

目前，随着基因测序技术的不断深入发展，二代基因测序技术也逐步取代一代基因测序成为主流的基因测序技术。该技术发展迅速，具有高通量、快速度、低成本的特点[24]。相比其他的基因测序技术，NGS无需基因克隆这一繁琐的过程，而是将连接同一通用型高通量测序接头的基因组DNA片段进行高通量的并行PCR及测序反应，所获得的大量测序数据经高效能的计算机生物信息技术分析整合即可获得完整的核酸序列信息[24]。近年来NGS也逐渐应用于淋巴瘤的精准诊断、基因异常、发病机制研究、化疗后疗效评估、预后评估和微小残留的监测等方面。基于NGS的深度测序(CAncer Personalized Profiling by deep Sequencing, CAPP-Seq)方法实现了迄今为止ct DNA分析的最低背景错误率和最低检测限值[25]。在一项研究中对30例接受R-CHOP方案治疗的新诊断的弥漫大B细胞淋巴瘤患者使用CAPP-Seq方法测序循环cf DNA，在对标准化治疗方案有应答的患者，循环cf DNA突变也可被迅速清除，而难治性DLBCL患者循环cf DNA突变持续存在，表明基于cf DNA测序检测特征性基因突变对治疗反应实时监测的有效性，敏感度达到90%，特异性达到100%[26]。使用CAPP-Seq方法对淋巴瘤患者治疗前后cf DNA测序的同时使用PET-CT评估实体肿瘤大小，并比较两者之间的相关性，从而对疾病进行动态监测[14]。总之通过NGS测序对淋巴瘤患者循环cf DNA特异性基因异常进行动态监测，可为淋巴瘤的早期诊断、治疗后评估及微小残留的监测提供新的方法，但目前该技术尚没有用于临床诊疗，其具体的临床应用和意义还有待进一步的研究和探索。

3.3 数字聚合酶链反应(digital, PCR)

虽然NGS技术的时间和经济成本已经较一代测序技术大为降低，但仍然价格不菲。数字聚合酶链反应(digital PCR)是近几年新兴的一种简便、快速、经济的核酸定量技术，只需要少量的血浆就可以对cf DNA进行分析；因此，dPCR可以成为血浆cf DNA分析的工具之一。dPCR的优点包括应用迅速、成本效益高、快速和高灵敏度和特异性，使其成为特定热点单核苷酸变异检测的有力工具，可以作为NGS的重要补充[23]。在实验中将NGS和dPCR方案结合起来用于液体活检，比较不同技术所需的成本和时间时，与NGS方案相比，dPCR工作流程方便的多，因为它需要更少的消耗品和周转时间来监视后续研究中的特定突变。此外，dPCR能够准确测定大量野生型DNA中的突变体DNA，即等位基因突变频率低的DNA(> 0.1%)，通常用于NGS结果的独立验证[27]。因此，dPCR可以联合NGS用于淋巴瘤cf DNA基因变异的检测，同时可以独立应用于NGS确定的特定核苷酸异常的动态监测，为淋巴瘤的基因诊断和ctDNA监测提供了更多可供选择的方案。

4 问题与展望

综上，淋巴瘤特别是DLBCL等高侵袭性淋巴瘤的基于细胞来源的病理分型已经不能准确指导靶向治疗时代的药物选择，基于基因突变的基因分型对靶向治疗选择的意义日益突出。淋巴瘤的实体性决定病灶取材远不如白血病等循环性肿瘤方便，为基因分型诊断和微小残留的检测带来困难。在诊断时采用NGS技术对组织和cf DNA进行测序，鉴定特征性基因变异进行基因分型，并在治疗后的疾病监测过程中利用dPCR技术检测cf DNA中特定基因含量的变化，将是一个既经济又方便的淋巴瘤基因诊断和疾病监测策略。当然，目前对于多数淋巴瘤类型来讲，对其基因变异特征以及特定基因变异类型的研究都未达到可以用来准确定义疾病基因类型的程度，尚有很多工作要做。基于目前研究进展，继续开展淋巴瘤特征性基因变异的鉴定，并不断开展研究分析验证其与淋巴瘤生物学特征、疾病预后的相关性，进一步制定基于NGS的基因分型策略和基于cf DNA的疾病监测策略是进一步研究的重要内容。