DNA损伤修复研究进展及其对围术期认知功能障碍的影响

戎玉兰，史成梅，郭向阳

(北京大学第三医院 麻醉科， 北京 100191)

DNA损伤在发育-衰老、神经退行性疾病以及肿瘤等病生理过程中发挥着重要的作用。近来很多研究发现，脑细胞DNA损伤和修复之间的失衡会造成神经元损伤，并影响多种神经退行性疾病的发生发展。多种内源和外源性因素会造成DNA损伤。不同刺激引起不同的DNA损伤类型，主要有碱基错配、碱基缺失、DNA单/双链断裂、DNA交联等，其中双链断裂(double-strand break,DSB)是最有害的一种损伤[1]。每个细胞每天大约会经历10 000次单链断裂损伤和10～50次DSB。如果DSB没有被修复或错误修复的话，会直接导致细胞死亡。DSB可通过两种途径进行修复[2]：同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(nonhomolog-ous ending joining,NHEJ)。增殖期细胞可以借助姐妹染色体通过HR进行精确修复DSB，而有丝分裂期后细胞中的DSB则主要通过NHEJ修复[3]。有效的修复对于维持神经元功能至关重要，并且编码DNA修复蛋白的基因与神经退行性疾病存在千丝万缕的联系[4]。

围术期认知功能障碍(perioperative cognitive dysfunction,POCD)是一种常见的手术麻醉并发症，以记忆、注意力、语言理解和社交能力的损伤为特征，可导致患者生活质量下降，延长住院周期、增加病死率，在老年人中的发病率高达25%～40%[5]，发生机制包括神经炎性反应、病理蛋白沉积、突触功能障碍、线粒体功能障碍、DNA损伤与修复失衡、持续的脑损伤等，其中，DNA损伤及修复失衡是极其重要的一种机制。本文将以DNA损伤修复过程中主要参与蛋白质的功能为重点阐明NHEJ修复机制，并简介其在POCD中的意义。

1 NHEJ的基本过程

NHEJ修复DSB的过程包括识别、联会、末端加工和连接。DSB发生后，Ku异源二聚体(Ku70/Ku80)最先反应，它快速识别断端并通过环状结构与断端结合，直接或间接招募NHEJ所需下游蛋白。同时Ku70/Ku80会迅速招募下游DNA蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase catalytic submits,DNA-PKcs)至断端，形成DNA-Ku-PKcs三元复合物，稳定断端，并进行联会。接着核酸酶Artemis被DNA-PKcs募集到DSB位点，剪切断端形成适合连接的结构。最后需要Ligase Ⅳ-XRCC4复合体、XLF和PAXX执行连接功能。

2 NHEJ的主要参与蛋白

2.1 Ku：快速识别蛋白

Ku二聚体由Ku70和Ku80组成，由基因XRCC6和XRCC5编码，根据来源患者的姓名首字母和蛋白质的大小(70 ku和83 ku)命名。首次发现是一种自身免疫抗原，其与DSB断端有高度亲和性[6]。两个蛋白含有相同的核心结构和N末端，只有C末端结构不同。它们可以组成稳定的环状结构套在DSB末端并向内滑动，通过Ku80 C末端与DNA-PKcs相结合[7]。Ku70/Ku80在DSB末端的加载是整个NHEJ修复过程中至关重要的一步。它不仅可以像枢纽一样与下游的修复蛋白合作，还可以与53BP1共同作用保护DSB末端免受核酸外切酶的加工[8]，并阻止其他修复方式的启动，比如HR等，从而起到选择修复通路的作用。NHEJ修复通路的大部分核心蛋白都与Ku产生相互作用[9]。

2.2 DNA-PKcs：稳定断端蛋白

DNA-PKcs分子质量高达469 ku，具有激酶活性。DNA-PKcs的N末端可以形成一个钳子样结构，为DNA提供结合通道。它与断端结合可发生自磷酸化，或被共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM基因)编码的ATM蛋白激酶或Rad-3相关蛋白(ATM and Rad-3 related,ATR)磷酸化，也可以磷酸化Artemis并与之结合，起到促进核酸酶活性的作用，其主要作用就是调节并加速NHEJ修复通路[10]。DNA-PKcs不仅在NHEJ修复通路中发挥着重要的作用，也参与调节DSB位点NHEJ和HR修复通路的选择[11]。

2.3 Artemis：末端加工蛋白

被识别的DNA断端经过加工，才能进行下一步的连接，通常参与的蛋白质具有多种功能。Artemis具有5′-3′核酸外切酶活性，在体内、体外可被ATM、ATR或PKcs等多种蛋白激活，并且在不同的损伤条件下，会发生不同的激活途径。Artemis与PKcs结合后，PKcs自磷酸化后可激活Artemis内切酶活性，切割突出末端以及V(J)重组过程中形成的发夹结构[12]。Artemis不仅是NHEJ修复通路的重要核酸酶，它同时也在调节细胞周期以及DNA损伤反应中发挥重要的作用[13]。

2.4 Ligase Ⅳ-XRCC4-XLF复合体：连接蛋白

Ligase Ⅳ只参与NHEJ修复通路，需要与XRCC4结合才能发挥作用。无论缺乏Ligase Ⅳ还是XRCC4都会出现对辐射敏感并且严重损害NHEJ修复通路[12]。XLF又称为Cernunnos，虽然与XRCC同源序列有限，但因与XRCC4结构相似而得名，二者均以二聚体形式存在。在人类细胞中，只有XLF可与DNA-PKcs相互作用，并与DNA断端结合形成核蛋白丝状结构，起到支架作用，促进末端连接[14]。XLF不仅在NHEJ中起到重要作用，还可以稳定DNA的复制过程[15]。

3 NHEJ对POCD的作用

保持基因的稳定性是每一个细胞的重要功能，因此每个细胞都具有大量高效的修复蛋白来保证基因稳定。当DNA损伤不能被修复或发生错误修复时，就会导致进行性的或持续的神经损伤，从而影响认知或运动功能[16-17]。研究提示，如果脑中DNA 损伤和修复失衡，会造成神经元损伤，学习和记忆受损，并且被证实参与了很多神经退行性疾病的病理生理过程，比如阿尔茨海默病、帕金森病以及肌萎缩性侧索硬化症等。POCD是一种与年龄相关的神经退行性疾病。课题组研究显示，围术期因素可以通过氧化应激反应，诱导中枢前额叶区DSB发生，相关标志物蛋白γH2A.X的表达显著增加，并在细胞核显著聚集[18]。麻醉暴露还可以抑制中枢海马区的P53水平，从而影响DSB程度，P53又可以影响NHEJ修复通路中的关键因子，从而调控NHEJ修复和细胞存活，另外NHEJ与P53之间也存在相互作用[19]。可见围术期因素可以影响DNA损伤和NHEJ修复之间的动态平衡，从而影响POCD的发生。

损伤和修复之间的失衡造成的DSB的积累是影响POCD的核心。减少DSB的发生，促进NHEJ，则成为干预、治疗POCD的新靶点。已经发现通过补充叶酸或S-腺苷甲硫氨酸可以抑制DSB等DNA损伤的发生。因此，通过抑制氧化应激反应等途径减少DSB的发生，可以降低POCD的发生率。对于脆弱脑细胞，NHEJ相关蛋白表达减少，从而造成DSB积累[20]，故如何促进NHEJ成为干预POCD的难点。

4 NHEJ近期研究进展

有关NHEJ的核心蛋白的研究已经很多，但是每个蛋白的具体工作机制还有很多需要探究，并且也有很多研究对NHEJ修复通路的经典过程提出了质疑和挑战。新的研究提示XRCC-XLF是NHEJ修复通路的新核心蛋白，Ligase IV并不是NHEJ修复通路的必需蛋白质，XLF-XRCC复合体可以在DSB末端形成袖套结构，并在DNA链上滑动，成功高效的修复DSB，不依赖于Ligase IV的存在[21]。细胞试验提示，与传统的NHEJ序贯修复过程相反，在损伤初期，DSB位点就会形成一个超级NHEJ复合体，其中包括DNA-Ku-PKcs和连接蛋白，这些蛋白既可以独立发挥作用，也可以相互促进，共同完成修复[22]。新的NHEJ调节复合物Shieldin(REV7、RINN1、RINN2、RINN3新型复合体)在2018年由多个课题组鉴定发现，它与CTC1-STN1-TEN1(CST)复合物相互作用，通过抑制DNA末端切除，促进NHEJ修复[23]。这些研究大大丰富了对NHEJ的认识。

5 问题与展望

虽然对于NHEJ修复通路的核心蛋白和机制已经研究的比较清楚，但其精确的作用方式及相互关系还存在很多空白：1)XRCC和XLF的C末端的结构还不是很清楚，在NHEJ中如何起到稳定作用？2)超级NHEJ复合体是否真的存在？3)POCD中，NHEJ修复通路是否受损？如何从修复角度进行干预，以影响POCD的发生和发展？

解决以上问题，需要结合蛋白组学、细胞生物学、有机化学等相关知识，深入研究NHEJ修复通路中的相关蛋白的空间结构，以及相互作用的顺序与位点，探究NHEJ修复通路分子机制中的空白和疑惑。应用细胞、动物模型研究P53、γH2A.X等关键因子与NHEJ修复通路的相互作用，从而揭示DSB和NHEJ之间相互影响的分子机制。并开展相关临床研究，探究脆弱脑功能患者的体液中，NHEJ修复通路相关蛋白的表达水平，以期能以NHEJ为核心，找到围术期认知功能障碍的干预新靶点。