肠道微生态对肠道免疫稳态和表观遗传修饰的调控作用及其与结直肠癌发生发展关系的研究进展

陈海彬,周红光,邱雯莉,李文婷,周洪立

（1.南京中医药大学科技处实验动物中心，江苏 南京 210046；2.南京中医药大学第一临床医学院肿瘤研究所，江苏 南京 210046；3.南京中医药大学附属医院肿瘤内科，江苏 南京 210009；4.南京中医药大学附属医院放射科，江苏 南京 210009）

结直肠癌（colorectal cancer， CRC）是最常见和最具破坏性的恶性肿瘤之一，虽然在CRC早期诊断和治疗策略方面取得了进步，但转移性CRC（metastatic colorectal cancer，mCRC） 患者的中位总生存期仍然不超过30个月［1］。2020年数据［2］表明：CRC已成为男性发病顺位第3、女性发病顺位第2和死亡率位居第3的高发恶性肿瘤，CRC在全球和中国的负担均在迅速增加。发生在50岁以下人群中的早发性CRC（early-onset colorectal cancer， EOCRC）在世界范围内的发病率呈明显上升趋势［3］。到目前为止，CRC发生发展的真正原因尚未完全明确。大量研究［4-6］显示：CRC的发生发展与多种宿主和环境暴露因素有关，Lynch综合征、家族性腺瘤性息肉病和Peutz-Jeghers综合征等影响CRC的总体风险。CRC的病因涉及遗传、心理和环境因素，同时与肠道屏障功能（intestinal barrier function， IBF）有密切关联，IBF包括肠道微生态、肠道免疫稳态、黏液层和上皮细胞4大要素［7］。正常结直肠上皮中表观遗传改变的逐步积累可促进CRC的发生，表观遗传修饰还可引发基因组不稳定性，通过组织侵袭和转移等过程参与CRC的启动和进展过程［8］。肠道微生态影响肠道免疫稳态和表观遗传修饰，参与CRC的发病，肠道微生态与CRC发生发展关系的研究越来越成为热点［9-10］。现结合相关文献和CRC的肠道微生态特点，探讨肠道微生态对肠道免疫稳态和表观遗传修饰的影响，深入了解CRC的肠道微生态特点和CRC高度富集微生物及其相关致病机制，尤其是肠道微生态在肠道免疫稳态和表观遗传调控中的作用，以期为更有效预防、诊断和治疗CRC提供理论依据。

1 肠道微生态、肠道免疫稳态和表观遗传修饰

肠道微生物从新生儿期开始出现，在幼年逐渐成熟并形成一个大型的、复杂而相对稳定的肠道微生态系统，既受饮食、药物、遗传、免疫、代谢、健康和疾病等多种因素影响，也影响着上述过程，表现出时间、空间和个体的变异性以及个体中整体组成的差异性，肠道微生态在宿主健康和疾病中发挥基础性作用，对人类健康产生深远的影响［11］。肠道免疫稳态是指肠道微生物、肠道黏膜、营养和代谢产物之间相互作用所构成的一种动态平衡状态，既可保证宿主对有害入侵病原微生物的有效识别及免疫反应的启动，又可对自身成分或共生微生物形成免疫耐受；肠道免疫稳态失衡会诱发各种疾病，如免疫反应过强容易罹患自身免疫性疾病，而免疫反应过弱则容易罹患肿瘤性疾病［12］。表观遗传修饰是指继发于基因表达变化的表型变化，虽然不涉及DNA序列的永久改变，但影响和操纵宿主的染色质配置和功能，强调基因和环境的相互作用。研究［13-15］表明：表观遗传修饰是可遗传的，表观遗传修饰可使后代适应特定的环境暴露；肠道微生态可以调节宿主的表观遗传修饰，特定的环境暴露又可通过表观遗传修饰塑造肠道微生态，影响肠道免疫稳态。健康状态下，肠道微生态自身平衡，并与宿主保持动态平衡，在肠道免疫稳态和表观遗传修饰中发挥重要作用。肠道微生态与人体健康和疾病的关系是目前微生物组学研究的热点。

2 肠道微生态紊乱促进CRC发生发展的假说

肠道微生态与CRC发生发展的相互作用和关联性一直是研究的热点。1997年的一项研究［16］显示：无菌ApcMin/+小鼠中段小肠肿瘤数量较普通环境下ApcMin/+小鼠明显减少，验证了肠道细菌是C57BL/6-ApcMin/+小鼠肠腺瘤形成所必需的假设，首次明确了肠道微生态与肠道肿瘤发生发展的关联，构建了肠道微生态紊乱可以促进CRC发生发展的假说。在CRC动物模型和患者中检测肠道微生物的研究［17］表明：不同阶段的CRC进展往往与明显的肠道微生态紊乱有关，高通量技术进一步揭示了肠道微生态的改变参与了结直肠黏膜缓慢发展成腺瘤并最终演变成CRC的整个过程，正常黏膜和癌前病变发展为CRC的多阶段疾病进展过程中肠道微生态发生了明显改变。对来自于中国、奥地利、美国、德国和法国的526份宏基因组样本的综合分析［18］显示：CRC患者与健康对照者的粪便总体细菌组成比较差异有统计学意义。对来自于中国的74例CRC患者和54名健康对照者的粪便标本队列研究［19］显示：CRC患者肠道微生物的多样性和丰度均较健康对照者明显降低；对配对的结直肠正常组织、结直肠腺瘤和CRC组织研究［20］显示：除肠道微生物种类和丰度改变外，肠道微生态结构的改变也参与了CRC多阶段发生发展的演变过程。研究［21］显示：肠道微生态丰度和结构的变化与CRC之间有密切关系。比较年轻个体（20～39岁）和老年人（大于60岁）肠道微生物的研究［22］表明：年轻个体较老年人更易获得健康肠道微生物的多样性。粪便样本的宏基因组和代谢组大型队列研究［23］显示：CRC发生发展中的肠道微生态表型具有阶段性，肠道微生态紊乱可能是CRC多步骤癌变过程中因果关系的表现。

3 肠道微生态影响肠道免疫稳态和表观遗传修饰及与CRC发生发展的关系

肠道是外部环境和免疫系统之间的复杂界面，肠道“微生物群”组成肠道微生态，其基因组被称为“微生物组”。1989年，有研究者［24］提出：在生命早期接触微生物可以对免疫系统健康产生积极影响。肠道微生态与CRC之间存在相互作用，肠道微生态是CRC的病因之一，并涉及多种机制，如慢性炎症、引起DNA损伤的基因毒素的产生和（或）有毒化合物的生物合成、短链脂肪酸（shortchain fatty acids，SCFAs）和胆汁酸等基础代谢因子等。肠道微生态还参与宿主对CRC患者化疗和免疫治疗反应的调节，如干扰药物疗效、不良反应、相关毒性和靶向菌群增强抗癌治疗的可能性等［25］，其原因可能与肠道微生态同时影响了肠道免疫稳态和表观遗传修饰有关。研究［3］表明：全球EOCRC呈上升趋势，虽然发病原因尚未完全明确，但潜在的风险因素包括大量摄入红肉、加工肉类、抗生素、合成食品染料、高果糖玉米糖浆、不健康的烹饪方法、肥胖、压力以及缺乏运动和（或）久坐行为等，上述与EOCRC发生发展相关的风险因素可能发生在儿童时期，特别是在孕早期至青少年时期，某些暴露会影响肠道微生态组成和功能的改变，影响微生物组与宿主相互作用，进而影响生命早期免疫系统的成熟和宿主肠道免疫稳态，引起结肠上皮细胞遗传和表观遗传修饰的改变等。另有研究［26］表明：CRC的复发在很大程度上是由肠道微生态的免疫和炎症相互作用并通过肠道免疫稳态失调和表观遗传修饰等介导的，CRC复发的危险因素包括遗传突变、表观遗传修饰、肠道微生态和肠道免疫稳态的重塑等。针对肠道微生物群、循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA开展相关试验，寻找特定的遗传标记，寻找肠道微生态、肠道免疫稳态和表观遗传修饰的相关生物标记，既可作为诊断生物标志物，也可作为治疗靶点，判断CRC复发风险，为CRC患者提供更精确和个性化的监测和治疗。

肠道微生态可通过多种方式对肠道免疫稳态产生影响，如双歧杆菌属的物种是健康人体肠道的正常居民，其种群数量和组成的改变是CRC等疾病最常见的特征之一，目前有研究［27］正在设计和进行准确的人体研究，以证实益生菌在预防、减轻或治疗CRC等疾病方面的功效。噬菌体是肠道微生态中最丰富的成员，具有塑造肠道微生态的潜力，噬菌体可以改变肠道免疫稳态从而影响哺乳动物的健康，加重肠道疾病。研究［28］表明：不断增加的噬菌体可诱导Toll样受体9（Toll-like receptor 9，TLR9） 和干 扰素 γ （interferon-γ，IFN-γ） 水平升高，进而加重葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的肠炎。

表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA和微小RNA（microRNA，miRNA）等。肠道微生态通过影响DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA，进而影响CRC的发生发展、侵袭和转移［10］。研究［29-32］表明：肠道微生态可以改变CRC相关基因的DNA甲基化；肠道微生态可能通过调节宿主中基因间长链非编码RNA（large intergenic non-coding RNA， lincRNA） 和miRNA的表达来影响CRC，涉及肠道上皮细胞中的let-7b、miR-141、miR-200a和miR-21-5p表达的变化。

3.1 肠道微生物 大多数CRC始于结肠和直肠内壁息肉的生长，随后发展为发育不良腺瘤，最终发展为CRC。动物实验和临床研究［33-38］均表明：不同阶段的CRC进展往往与CRC患者肠道微生态紊乱有密切关联，肠道微生态中的一些微生物群成为可能直接或间接影响CRC肿瘤微环境结构成分以及自由基和酶代谢物的潜在危险因素，高通量技术有助于CRC患者肠道微生态紊乱中关键微生物的鉴定。具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，Fn）是一种与牙周病有关的口腔常见的革兰阴性厌氧菌，Fn与CRC发生发展有密切关联。2012年KOSTIC等［33］首次发现Fn在CRC组织中较正常组织明显富集，并采用荧光定量PCR法、荧光原位杂交和数字滴式PCR技术在大肠肿瘤组织中进行了验证，荧光定量PCR法检测结果显示：99例CRC组织标本中Fn的平均总丰度比相应的正常黏膜组织高415倍；偏转录组测序和宏基因组分析及临床治疗研究均证实：CRC组织中Fn丰度比健康组织高；75%CRC患者唾液和口腔组织中均检测到匹配的Fn株，提示CRC组织中Fn可能起源于口腔，消化道传播可能是其扩散的机制之一。肠道腺瘤和锯齿状息肉属CRC的癌前病变，研究［39-40］表明：与健康组比较，肠道腺瘤患者粪便中嗜胆菌、脱硫弧菌、棒状杆菌和考拉杆菌的丰度明显升高，而肠道锯齿状息肉患者中丹毒杆菌和梭杆菌的丰度明显升高；随着腺瘤和锯齿状息肉发展为CRC，肠黏膜组织中致病微生物产生的毒素如核梭杆菌和脆弱拟杆菌产生的细胞毒坏死因子和周期抑制因子也呈增加趋势；部分侵入性微生物群如侵入性大肠杆菌 （enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）的丰度呈上升趋势。另有研究［41-43］显示：CRC患者肠道驻留病毒丰度明显高于健康人群，细菌种类明显降低，并确定了与CRC相关的病毒特征，在发病过程中，肠道噬菌体对不同种属链球菌具有调节作用，如链球菌引发的心内膜炎与CRC发生有关；CRC患者肿瘤组织中人乳头瘤病毒（human papilloma virus， HPV）呈阳性，其中HPV16是最常见的类型，提示HPV可能影响CRC的发生发展。

肠道微生态中关键微生物在CRC发病中的作用机制目前已成为研究的热点，Fn已成为CRC的一种危险因素。一系列基础研究［44-48］结果显示：在APCmin/+小鼠模型中，Fn通过招募骨髓源抑制性细胞浸润至CRC组织周围，改变肿瘤微环境促进肿瘤生长；Fn的潜在毒性和破坏肠上皮细胞的能力主要是由Fn效应蛋白黏附素A（Fn effector adhesin A，FadA），一种调节细菌黏附和侵袭的毒力因子产生的，其可作为CRC的潜在诊断和治疗靶点，CRC标本中FadA基因表达水平明显高于邻近正常组织，Fn通过黏附和入侵肠上皮细胞，释放FadA与E钙黏蛋白结合，激活β-连环蛋白（β-catenin）信号通路，促进结直肠炎症，刺激CRC细胞的生长。Fn通过激活Toll样受体2（Toll-like receptor 2， TLR2）/Toll样 受 体 4（Toll-like receptor 4，TLR4）信号通路，增加炎症介质的表达，对结肠肿瘤微环境及炎症介质和miRNA表达产生影响，促进CRC转移。

研究［49-52］显示：Fn已成为CRC患者的临床生物标志物和新的治疗靶点，Fn促进了CRC细胞的上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），Fn是Ⅲ/Ⅳ期CRC患者临床管理的一种新的预测性生物标志物；Fn感染增加了体外和体内巨噬细胞M2极化，产生免疫抑制作用，导致ApcMin/+小鼠肠道肿瘤生长，Fn感染以TLR4依赖的方式促进CRC的生长，该过程涉及多种信号通路的激活，可成为Fn相关CRC免疫治疗的一个有前景的靶点；Fn通过损伤相关分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP）S100A9的表达改变，影响M2巨噬细胞的极化，抑制宿主抗肿瘤免疫，促进CRC发展。靶向TLR4/核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）/S100A9级联反应可能是一种很有前景的Fn相关性CRC免疫治疗策略。

研究［53-55］表明：人类肠道中的其他菌种，如脆弱拟杆菌和厌氧消化链球菌等也可促进CRC发生发展；测序和培养技术检测结果显示：肠息肉患者和非肠息肉患者之间以及不同肠息肉亚型患者之间不同的微生物特征和脆弱拟杆菌的恢复与息肉附近黏膜的炎症细胞因子水平有关联，可能的机制是通过TLR4激活NF-κB，诱导促炎症反应；厌氧消化链球菌与结肠细胞的TLR2和TLR4相互作用，增加细胞的氧化应激水平，增加细胞内胆固醇的合成，激活促癌分子信号通路，促进CRC细胞增殖和肿瘤形成；厌氧消化链球菌的表面蛋白质通过与肠上皮细胞表面受体直接结合，激活磷脂酰肌醇信号途径，诱导骨髓来源的抑制性细胞，建立免疫抑制性肿瘤微环境，促进小鼠CRC的发生发展。

3.2 肠道微生物源代谢调节物 通过识别肠道微生态中关键微生物与其宿主之间传递的分子信息，可以了解其如何影响肠道免疫稳态和表观遗传调控及对CRC发生发展的影响。微生物在肠道中代谢膳食纤维时产生的化合物即为微生物源代谢调节物，一些活跃的微生物源代谢调节物已被发现与肠道细胞之间具有复杂的相互作用，可通过修饰肠道细胞甲基化和组蛋白结构、调节和重塑宿主表观遗传修饰及肠道免疫稳态等方式，在CRC侵袭和转移过程中发挥着关键作用［56］。目前研究最深入的是SCFAs，一种既不被宿主消化也不被吸收的膳食纤维经胃肠道中的微生物发酵产生的分子，SCFAs不仅是肠道微生物本身的重要能量来源，也是肠上皮细胞的关键能量来源，可影响胃肠道上皮细胞完整性、增强肠屏障功能和减少氧化应激反应。SCFAs还具有多种调节功能，包括对宿主生理调节（调节食欲、葡萄糖体内平衡和脂质代谢）和免疫调节（肠道免疫稳态的调节），并会影响肿瘤的发生发展和防治［57］。丁酸是SCFAs的一种，通过细胞代谢、微生物稳态、抗增殖、免疫调节和遗传/表观调控等途径，产生抗炎和抗肿瘤作用，保护结肠上皮细胞免受肿瘤的侵袭，降低CRC的风险［58］。

研究［59-61］显示：SCFAs可通过多种不同但相互关联的机制降低CRC的风险：SCFAs可通过促进肿瘤细胞凋亡，在BALB/c裸鼠中发挥抗CRC作用；SCFAs可改善肠道微生态结构，促进有益微生物增殖，酸性条件能更好地支持生产丁酸盐的厚壁菌（罗斯氏菌属）的生长，同时减少酸敏感型拟杆菌属的增殖；SCFAs通过降低肠道pH值抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原微生物的生长，减少有毒发酵产物的形成，降低CRC的发生；SCFAs是肠道免疫稳态的关键参与者，可诱导肠上皮细胞分泌抗菌肽和黏蛋白，促进肠上皮紧密连接以及促进B细胞分泌IgA至黏液层等，维持肠道黏膜屏障的完整性，增强肠上皮细胞的免疫监视功能和屏障功能，维持和调节肠道免疫稳态；SCFAs可作为组蛋白去乙酰酶抑制剂而影响表观遗传修饰，促进耐受性及抗炎症细胞的分化和增殖，调节和维持肠道免疫稳态，发挥抗CRC作用；SCFAs与其受体相互作用可以调节和维持肠道免疫稳态，抑制慢性炎症和CRC的发展。

胆汁酸是在肝脏中合成并由肠道微生物进一步代谢的众多代谢产物之一，对维持健康的肠道微生物群、平衡脂质及碳水化合物代谢、胰岛素敏感性和先天免疫至关重要［62］。研究［63］表明：胆汁酸等其他肠道微生物源代谢调节物也与CRC发生发展有关，其作用机制涉及2种主要的胆汁酸敏感受体，通过益生菌、二甲双胍、熊去氧胆酸和粪便菌群移植等手段及靶向胆汁酸-微生物轴可预防和治疗CRC。

肠道微生态通过微生物源代谢调节物与表观遗传修饰和肠道免疫稳态之间交互作用进而影响CRC已受到广泛关注，微生物源代谢调节物是宿主-微生物相互作用的产物，通过影响细胞凋亡、细胞信号和细胞周期等多种生物机制，在CRC的发生、进展和恶化中发挥作用，可用于CRC的诊断、预后判断和治疗［64］。当然，在考虑其对CRC的影响时，应该综合考虑遗传背景、细胞能量学和环境背景等多种因素，还需要借助代谢组学、亚转录组学和亚蛋白质组学等强大的组学工具及其他多学科方法和手段，以更好理解肠道微生态中某些微生物及其代谢调节物的抗CRC特性［65］，为CRC的预防和治疗提供新的切入点。

4 结语与展望

肠道微生态具有帮助宿主获取基本的营养物质和能量、维持肠道屏障的完整性、调节多种免疫细胞、调节肠道免疫稳态和表观遗传修饰等多种功能，在CRC发生发展和防治中发挥重要作用。随着微生物组学研究手段的发展，肠道微生物的组成、结构、丰度、功能和代谢物等与CRC发生发展的关联性被不断证实。肠道微生态在CRC精准诊疗和个性化治疗中发挥着重要的作用，值得进行深入探讨。本课题组将在前期研究基础上，采用微生物组学、细胞生物学、计算生物学和生物信息学等多学科交叉融合的研究方法，将中医药抗CRC研究与肠道微生态、肠道免疫稳态和表观遗传修饰研究相结合，从肠道微生态及其调控网络角度解读中医药抗CRC的生物学基础，寻找CRC的潜在治疗靶标，为提高CRC疗效提供依据。