肾脏类器官血管化的研究进展

丁坤 ，管勇 ，孔峰 ，赵升田

1山东大学，山东济南 250100；2山东省立医院泌尿外科，山东济南 250021；3山东第一医科大学附属省立医院泌尿外科，山东济南 250021

慢性肾脏病（CKD）指各种因素引起的慢性肾脏结构和功能障碍，高血压和糖尿病是重要的原因［1］，同时，伴随着人口老龄化，其已经呈现出流行的态势［2］。除了作为心血管系统疾病、脑卒中等的危险因素外［3-4］，其进展导致的终末期肾病（ESRD）也成为人口死亡的重要因素之一［5］。透析或肾脏移植是主要治疗手段，然而透析需要定期进行，长期治疗可能导致诸如溶血［6］、炎症综合征［7］等并发症，严重时可能危及生命；肾脏移植作为目前最为有效的肾脏替代治疗方案，目前存在肾源紧张［8］、排斥反应［9］等难点，这些都为CKD、ESRD的治疗带来了巨大的挑战。当前，再生医学成为ESRD治疗的研究热点，肾脏类器官作为其研究方向之一，获得了广泛关注，它是以体内肾脏发育过程为指导，通过控制Wnt等多个信号通路［10］，以干细胞等作为种子细胞，经历自原条到肾祖细胞各个分化阶段后构建的3D细胞团组织［11］。然而，现有的肾脏类器官在构建过程的后期普遍存在内部氧气、营养分布不均的问题［12］，导致其无论在体积还是内部结构的成熟性都不足以应用于再生领域，而血管化则是突破这些局限的重要因素。现就肾脏类器官血管化的研究进展进行综述。

1 体内移植血管化

肾脏作为高度血管化的器官，接收全身约五分之一血流量，了解肾脏血管的来源，是促进肾脏类器官血管化的重要一步。血管的产生包括血管新生和血管形成两种形式［13］，目前多认为，肾脏的血管来源具有双重性：一方面，胚胎的肾间充质自身便存在着血管前体细胞，其能够通过分化、迁移等产生肾脏血管，这属于“血管新生”的过程；另一方面，胚胎发育的过程中，一些来自外部的血管也会通过出芽等方式生长至肾脏内部，即“血管形成”，并与肾内的血管祖细胞共同形成肾脏血管系统［14］。

由于肾脏发育过程中血管存在双重来源的机制，将培养后的类器官进行体内移植便有可能通过“血管形成”过程将其血管化。因此VAN DENBERG等［15］所在的研究团队使用人多能干细胞构建肾脏类器官后，进行了长期培养和体内移植培养的对比试验。相较于体外的单纯长期培养，移植入小鼠肾被膜的类器官在2周后出现了宿主来源的血管内皮，且随着培养时间的延长，其小管组织也开始成熟，内皮亦出现孔状结构。此外，RYAN等［16］使用胚胎干细胞构建肾脏类器官时，在培养早期，类器官内可以发现不断增加的内皮细胞，然而12 d后，内部的血管结构便开始减少，而被植入小鼠体内的类器官则表现出良好的血管化。

除了将类器官进行小鼠肾被膜下移植外，鸡绒毛尿囊膜（CAM）也是良好的移植选择。GARRETA等［17］将分化至第16天的类器官移植入CAM中维持5 d，发现类器官中出现多条肉眼可见的血管，且观察到类似鲍曼囊和小管样的结构，提示类器官具有了一定程度的血管化并开始成熟化。由于CAM自身即是一种天然免疫缺陷环境，不需同肾被膜下移植一样需要使用免疫缺陷小鼠，移植的过程相对而言更为经济且简便。

另外，优化移植前的培养方案，也可以促进移植后的血管化。以往的肾脏类器官诱导方案中，每一步均是对所有细胞的同步诱导分化，但有研究认为，这并不符合肾脏发育的自然过程，因为肾脏发育并不是单一的时间线，而是祖细胞逐渐流入已分化的细胞群中继续分化［18］。因此KUMAR等［19］提出将不同时段分化的前体细胞进行混合后继续培养的诱导方案，他们在细胞诱导第11天时，再次加入诱导第9天时获取的肾祖细胞，通过异时相混合培养后发现，前一批次细胞优先分化为远端小管上皮和间质细胞，后一批次则优先分化为足细胞和近端小管。随后他们将其进行了体内移植，相比普通诱导培养的类器官，混合培养后的类器官表现出更为广泛的血管化，并具有更多的肾单位结构，提示其成熟度的提升。

总体而言，体内移植后的肾脏类器官有较好的血管化及成熟性，对比传统培养有着极大的优势，改善了肾脏类器官进行疾病模拟或药理毒理验证时的效能。但是目前而言，其内部的血管网络尚不成熟，无法实现功能性的灌注，且仍不能达到近似成人肾脏的成熟度，因此暂时不能满足再生医学的需求。而移植前对类器官的培养方式等也会影响移植后类器官的血管化及发育程度，因此，单纯依靠体内移植进行血管化可能并不足够，在移植前进行体外培养的调整或者体外部分血管化，可能会有助于获得更为成熟的肾脏类器官［20］。

2 体外培养血管化

对比体内移植的方案，体外培养环境缺乏体内血流、因子作用等相关有利因素的影响，但也带来了更为灵活的调整空间，能够为类器官提供更为多样的培养模式。因此，各研究团队采用多种方法尝试调整体外构建与培养方案，如对环境条件进行模拟，或者对信号通路进行更为精确的调控等，从而验证促进其血管化的条件要素，进一步完善培养方案，以通过“血管新生”等途径在体外实现类器官血管化。

2.1 物理环境模拟 传统静态环境下培养的类器官相比体内移植的类器官而言，产生血管网络的难度较大，而以往的报道指出，体液流动等带来的剪切应力与内皮血管网络的形成存在相关性［21-22］。因此，HOMAN等［23］在培养过程中引入流体控制系统，从而模拟肾脏发育时体液流动的环境。培养方案以微流控芯片作为类器官的载体，其上方为流动的培养基，为肾脏类器官提供流体剪切应力环境。试验发现，通过流体培养的类器官有了明显的成熟化表现，出现了小管上皮和足细胞，并有类似血管内皮网络向肾小球结构扩张的现象，测定显示其血管内皮生长因子-A（VEGF-A）的表达也显著上调，这些都是有利于血管产生的因素。同样，LEE等［24］所在的研究团队通过构建肾脏类器官芯片，比较了在流体作用下肾脏类器官的发育情况，与HOMAN团队的研究结果相似，在流体剪切应力的影响下，类器官内出现了更为明显的血管形成和足突状结构，提示其促进了类器官的内皮分化及成熟。由此可见，进行体外培养时，模拟体内脏器发育时的力学等物理因素具有促进肾脏类器官成熟及血管化的潜力，这是既往单纯的静态培养条件下无法实现的效果。

2.2 细胞信号通路水平的精细化调控 随着肾脏类器官体外培养方案的日益成熟，构建简单的类器官已经不会有较大的困难，但培养方案大多无法控制类器官内部单位的结构组成，难以在体外产生更好的脉管结构。由于发育中的肾单位，其结构与βcatenin活性具有节段性相关，而Wnt信号通路能够通过典型β-catenin信号传导诱导肾单位的形成［25］，因此LOW等［26］提出从细胞信号通路着手，尝试通过调控类器官生长过程中的诱导信号强度，形成相对合适的肾单位结构比例，从而产生血管。他们计划性地使用GSK-3抑制剂CHIR99021控制Wnt通路，从而调节肾单位不同节段的诱导分化，使肾小球结构所在的近端节段与小管结构所在的远端阶段达到最佳比例，保证其具有能够自主维持一定水平VEGF-A的能力，从而在类器官中产生了血管内皮网络。将诱导过程进行分节段精细化调控是肾脏类器官培养模式的一大突破，实现了对类器官分化结构更为细致的可控性，这对于其他类器官的血管化诱导也具有参考意义。

2.3 结合生物材料的培养模式 随着材料科学的进步，生物材料的引入使得肾脏类器官的血管化有了新的突破。已有的研究证实，多能干细胞等种子细胞结合肾脏脱细胞支架后可以出现相应分化，产生肾小球等结构［27-29］，表明肾脏的细胞外基质（ECM）可以为干细胞向肾单位结构分化、成熟提供机械支持以及相应的生化微环境。因此，KIM等［30］将猪肾进行脱细胞处理后获取的ECM制备成为水凝胶，并使用诱导多能干细胞作为种子细胞进行肾脏类器官的培养，通过与普通培养方式获取的类器官相比，添加ECM后的肾脏类器官表现出了更为明显的血管内皮网，这一现象在加入VEGF后更为明显，且ECM水凝胶促进了肾小球结构的血管化以及肾小管结构的生成。可见，ECM对于肾脏的发育成熟具有重要作用，在促进肾脏类器官的血管化及成熟方面具有不小的优势。但需要注意的是，研究应用的ECM是生物来源材料，制备耗时长，过程复杂，在大规模应用中存在限制。而目前的研究仅是将肾脏ECM作为整体进行相关的培养试验，对于不同位点促进细胞向肾单位不同结构分化的细胞通路等机制尚不能完全明确，这也就不能为理想的人工合成ECM材料提供更加有效的参考信息，所以相关的机制需要后续研究进一步阐明。

2.4 生物3D打印的潜力 生物3D打印技术是近些年组织工程学的研究热点之一，因其能够通过受控沉积进行复杂立体结构的构建，相比通过诱导产生血管网络而言，其具有效率高、可控性强等优势，短时间内即可完成类似“血管新生”的过程并形成灌注。因此，有关3D打印构建血管网络的研究正在不断推进，目前主要通过使用含有特定细胞的生物墨水在水凝胶等材料中进行血管等组织的“打印”，已有一些团队证实了3D打印血管结构的可行性［31-32］。SINGH等［33］以ECM为基础，分别制备含有肾近端小管上皮细胞和人脐静脉内皮细胞的生物墨水，进行了血管化近端肾小管芯片的打印，对打印后的组织芯片培养后进行检测发现，其具备了较好的成熟标记物表达，将其进行小鼠肾被膜下移植后，也出现了宿主来源的血管化，提示其构建的有效性。需要注意的是，目前的相关研究以实现简单原理式构型打印为主，虽然有团队通过3D打印进行了可重复性批量小型肾脏类器官的制备［34］，但其仍未能达到理想的血管化程度。受限于肾单位及其周围血管复杂的解剖结构、打印体积的限制等，当前对于更为复杂的大体积血管化肾脏类器官的打印尚未实现，但这一技术具备的巨大潜力不可忽视，随着高精度生物3D打印技术的发展，其未来可能具有最大的优势。

3 结语

人口老龄化的加剧，高血压、糖尿病等慢性病患病率不断上升，导致全球CKD和ESRD患者数量不断增长，给患者的健康和保健医疗机构带来巨大的压力。近些年来肾脏类器官的出现是肾脏再生医学的里程碑，而人诱导多能干细胞的出现，为类器官提供了丰富的种子细胞，也使得降低免疫排斥等风险成为可能。肾脏类器官具有治疗CKD、ESRD的巨大潜力，对于肾脏的再生医学有着重要意义。但是目前的肾脏类器官还无法完全满足这些需求，组织结构的不成熟性、缺乏完善的血管灌注等，都限制了其进一步发挥作用，因此，越来越多的研究开始致力于解决这些问题。

本文总结了近几年来常见的肾脏类器官血管化的研究方案，就总体上看，将类器官进行体内移植依然是实现血管化最为有效的方式，但是其仍难以达到理想的血管化程度，可能需要体外培养的辅助，其距离投入临床应用还有很长的路要走。体外血管化方案虽然相对简便，并且对类器官的生长培养环境有着极为灵活的可操作性，但目前已有的方案中，其形成的脉管网络尚未能证实存在有效的血液灌流，3D打印虽然拥有解决这一问题的潜力，但其研究仍处于起步阶段，这些都是当下类器官体外培养需要面对的挑战。

随着干细胞技术水平的进步，培养设备技术的更新，医学新突破的不断出现，肾脏类器官的研究将会被逐步向前推进，直到具有理想结构与功能性的类器官真正出现。在老龄人口不断增加、患病人数不断增长的现状下，这将会为人类对于肾脏疾病的研究，新药的研发，CDK、ESRD的治疗带来有力的支持，为再生医学的进步提供源源不断的动力。