单宁酸沉淀淀粉行为的研究

刘子隽， 胡秀婷

(南昌大学食品学院，南昌 330047)

淀粉是天然可再生资源，是人类获取能量的主要来源。由于淀粉来源丰富、价格低廉及其本身的特殊性质，被广泛应用于生物医药、食品工业、化学工业等领域[1]。目前，淀粉的分离纯化主要依赖于沉淀法，已报道的淀粉沉淀剂主要为甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，其中，乙醇因其可食用性被广泛使用[2]。乙醇等有机溶剂沉淀淀粉的原理在于可以改变原淀粉溶液体系的极性，使淀粉在溶液中的溶解度降低，从而使沉淀析出[2]。但有机溶剂沉淀法具有沉淀效率低、成本高、安全性低(易燃易爆)等缺点。近年研究发现聚乙二醇也可作为淀粉的沉淀剂，其沉淀机理为聚乙二醇和淀粉在水溶液中具有不相容性[3,4]；虽然聚乙二醇作为固体沉淀剂其沉淀效率远高于乙醇[4]，但固体沉淀剂聚乙二醇的分子量对沉淀效果具有显著影响，然而聚乙二醇作为聚合物，分子量分布不均一，这导致操作重复性较差[5]。

单宁酸是一种存在于天然植物中的多酚类化合物[6]，可通过氢键或疏水作用与蛋白质分子反应使蛋白质沉淀，故可作为蛋白质的沉淀剂[7,8]。此外，也有研究表明单宁酸与多糖会发生类似于与蛋白质相同的反应过程，使多糖沉淀析出[9]，如单宁酸对魔芋葡聚糖具有显著的亲和力，可形成不溶性沉淀[10,11]；向小麦淀粉中添加单宁酸，也可使小麦淀粉从水溶液中沉淀析出[12]。

研究表明单宁酸可能作为淀粉的沉淀剂，然而，单宁酸沉淀淀粉的过程鲜有系统报道。因此，本研究以淀粉得率为指标，研究淀粉浓度、单宁酸添加量、环境温度等因素对单宁酸沉淀淀粉过程的影响，并初步探究单宁酸沉淀淀粉的机理，为淀粉的分离纯化工艺提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米淀粉(实验室自制)；大米淀粉(市售)；单宁酸(分析纯)；盐酸(分析纯)；氢氧化钠(分析纯)；用0.2 mol/L的醋酸溶液和醋酸钠溶液配制pH为4.0的缓冲液(现配现用)；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

LXJ-IIB低速离心机，FLOM超纯水机，SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵，FiveEasy Plus pH计；Bede D1 HR X射线衍射仪，MicroCal PEAQ-ITC等温滴定量热仪。

1.3 方法

1.3.1 淀粉浓度、单宁酸添加量对淀粉沉淀过程的影响

配制淀粉溶液：称取一定量的淀粉，溶于缓冲液中，在90 ℃下水浴糊化1 h，得到质量浓度为1.0%、2.0%、4.0%的淀粉溶液。

取糯米淀粉溶液与普通大米淀粉溶液，加入单宁酸粉末，使单宁酸与淀粉质量比分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0。在室温下磁力搅拌1 h，使单宁酸在样品溶液中溶解完全，静置24 h后，将样品溶液于离心机中在8 000 r/min下离心15 min，除去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后称重，计算不同质量比下淀粉的得率。淀粉得率计算公式为：

式中：Y为淀粉沉淀得率/%；M为干燥后淀粉沉淀质量/g；m为淀粉溶液中淀粉干基质量/g。

1.3.2 沉淀时间对淀粉沉淀过程的影响

向质量浓度2.0%淀粉溶液中加入单宁酸，待单宁酸充分溶解后，将淀粉-单宁酸混合体系放置于室温下静置2、4、8、12、24 h。将静置不同时间的样品溶液于离心机中在8 000 r/min下离心15 min，并用无水乙醇洗涤沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后称重，计算不同沉淀时间下的淀粉得率。

1.3.3 沉淀温度对淀粉沉淀过程的影响

分别向质量浓度为2.0%的糯米淀粉溶液与普通大米淀粉溶液中加入单宁酸，待其充分溶解后，分别放置于25、4 ℃下静置24 h后，将样品溶液于离心机中在8 000 r/min下离心15 min，并用无水乙醇洗涤沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后称重，计算不同温度下的淀粉得率。

1.3.4 体系pH对淀粉沉淀过程的影响

向质量浓度为2.0%的淀粉溶液，通过添加NaOH溶液或HCl溶液调节体系中的pH，使其pH的范围为3.0～11.0，然后加入单宁酸。最后将不同pH的样品溶液放置室温静置24 h，将样品溶液于离心机中在8 000 r/min下离心15 min，并用无水乙醇洗涤沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后称重，计算不同pH条件下的淀粉得率。

1.3.5 金属离子对淀粉沉淀过程的影响

向质量浓度为2.0%的淀粉溶液中加入0.20 mol/L氯化铝、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锌溶液后再加入单宁酸，充分搅拌使单宁酸溶解完全。将样品溶液放置室温静置24 h后，将样品溶液于离心机中在8 000 r/min下离心15 min，并用无水乙醇洗涤沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后称重，计算淀粉得率。

1.3.6 X射线衍射(XRD)分析

向2.0%的淀粉溶液中加入单宁酸，于室温下静止24 h后，置于离心机中在8 000 r/min下离心15 min后，将沉淀放于烘箱55 ℃干燥。取少量干燥后的复合物样品充分研磨至粉末状态，放入X射线衍射仪中进行检测，得到XRD图谱。测定条件为电压40 kV，电流40 mA。衍射角(2θ)扫描范围设为5°～50°，步长为每秒0.02°。利用Origin软件进行分析。

1.3.7 等温滴定量热(ITC)分析

采用MicroCal PEAQ-ITC测定单宁酸与普通大米淀粉、糯米淀粉的相互作用。淀粉和单宁酸均使用醋酸缓冲溶液溶解。将10 g/L的单宁酸溶液每次3 μL分13次滴入200 μL的滴定池中，该滴定池装有pH 4.0的缓冲液或0.4 g/L的淀粉溶液。每次滴入持续24 s，每次滴定间隔时间为180 s，实验过程搅拌速度307 r/min。滴定池溶液的温度设置为(25±0.1)℃。根据设置滴定时间，对每次滴加单宁酸时的吸热或放热的数据进行记录。利用MicroCal PEAQ-ITC Analysis软件计算单宁酸与淀粉相互作用的热力学参数，建立“one set of sites”模式来拟合等温线，该模型假设淀粉上的所有的绑定位点都是相同的。

2 结果与分析

2.1 淀粉浓度、单宁酸添加量对淀粉沉淀过程的影响

图1是在淀粉质量浓度分别为1.0%、2.0%、4.0%时，向淀粉溶液中添加不同质量的单宁酸后，淀粉得率的变化。如图1所示，单宁酸添加量对淀粉得率具有显著的影响。以淀粉质量浓度为2.0%为例，在相同的单宁酸与淀粉质量比条件下，单宁酸对普通大米淀粉的沉淀效果优于糯米淀粉，这可能是因为普通大米淀粉中直链含量高于糯米淀粉。对于普通大米淀粉，随着单宁酸与淀粉的质量比不断增加，普通大米淀粉和糯米淀粉得率显著增加，在质量比为0.6时，普通大米淀粉得率为92.0%，而当单宁酸与淀粉质量比到达0.6时，进一步添加单宁酸不会导致普通大米淀粉得率的显著增加。因此，认为在单宁酸与普通大米淀粉质量比为0.6时，普通大米淀粉得率达到最大值。对于糯米淀粉，在质量比为0.8时，糯米淀粉得率为86.5%，而继续增加单宁酸与淀粉的比例，发现沉淀得率无显著性增加。因此，认为当单宁酸与糯米淀粉质量比为0.8时，单宁酸对糯米淀粉的沉淀效果最好。而在乙醇沉淀2.0%淀粉溶液的过程中发现，当在乙醇与淀粉溶液体积为5∶1时，淀粉得率达到最大值，为79.9%[13]。由此可见，单宁酸对淀粉的沉淀效率远高于乙醇。

图1 单宁酸沉淀普通大米淀粉和糯米淀粉过程

此外，在单宁酸与淀粉质量比为0.1～0.2的范围内，沉淀得率都处于较低水平，这可能是因为在该范围内，淀粉与单宁酸主要形成的是可溶性复合物，而随着单宁酸与淀粉的质量比的进一步增加，复合物开始聚集，并逐渐形成不溶性复合物沉淀。当改变淀粉的质量浓度，沉淀淀粉所需的单宁酸量亦有显著性变化，这表明沉淀淀粉所需的单宁酸量对淀粉的质量浓度具有依赖性。

2.2 沉淀时间对淀粉沉淀过程的影响

由图2可知，随着沉淀时间的增加，普通大米淀粉与糯米淀粉沉淀得率逐渐增加，即当沉淀时间由2～6 h时，2种淀粉得率均迅速上升，并在6 h基本达到最大值；而继续延长沉淀时间，淀粉得率没有显著增加。因此，单宁酸沉淀淀粉最佳时间为6 h。与文献报道中乙醇沉淀长时间(静置过夜或24 h)相比[14]，单宁酸沉淀淀粉效率更高。

图2 沉淀时间对淀粉得率的影响

2.3 沉淀温度对淀粉沉淀过程的影响

如图3所示，在相同温度下，普通大米淀粉的沉淀得率均高于糯米淀粉，这可能是由于普通大米淀粉与糯米淀粉中的支链淀粉与直链淀粉含量不同，导致2种淀粉与单宁酸结合的程度不同。当沉淀温度由4 ℃升至25 ℃，两种淀粉溶液体系中的淀粉沉淀得率无显著性差异，说明在单宁酸沉淀淀粉过程中，温度变化并不是影响淀粉沉淀的主要因素。但考虑能源消耗的因素，选择25 ℃为沉淀淀粉的最佳温度。与醇沉淀粉的过程大多都在低温下进行相比，单宁酸沉淀淀粉过程能量消耗更少。有研究在4 ℃和37 ℃下使用聚乙二醇沉淀淀粉时发现，聚乙二醇对温度变化也不敏感，沉淀得率没有显著性差异[15]。这与本实验结果一致，推测这可能是固体沉淀剂的特有性质。

图3 不同温度(4、25 ℃)对淀粉得率的影响

2.4 体系pH对淀粉沉淀过程的影响

如图4所示，pH对普通大米淀粉、糯米淀粉的得率具有显著影响，且得率都随着pH的升高而降低。在pH 3.0～5.0条件下，淀粉得率较大，而在pH 6.0～11.0条件下，得率相比酸性条件降低。导致这些现象的原因可能是：随pH的变化，单宁酸酚羟基的电离程度发生了改变使得沉淀过程也发生变化。研究报道发现，单宁酸质子化程度会影响单宁酸与其他生物分子相互作用的方式和强度[16]。单宁酸的pKa值范围在7.5～13.5之间，在pH 3.0～5.0条件下，单宁酸上的羟基几乎完全被质子化，使得淀粉与单宁酸之间的相互作用加强，从而使得淀粉得率增加。

图4 pH对淀粉得率的影响

2.5 金属离子对淀粉沉淀过程的影响

单宁酸可通过其结构单元上的酚羟基与金属离子进行配位，发生络合反应，从而对单宁酸沉淀蛋白质的过程产生影响[17]。因此，本文亦研究了金属离子的添加对单宁酸沉淀淀粉影响。从图5中可以发现，加入金属离子后，普通大米淀粉和糯米淀粉的得率没有显著差异，这表明金属离子的存在对单宁酸沉淀淀粉无影响。这可能是由于单宁酸与金属离子之间的配位键作用并不影响单宁酸与淀粉的相互作用。

图5 金属离子对淀粉得率的影响

2.6 单宁酸-淀粉复合物X射线衍射分析

不同类型的淀粉具有不同的晶型，在X射线衍射图谱中的衍射峰不同。根据其晶型主要分为四类：A型、B型、C型以及V型。A型、B型、C型图谱在天然淀粉中比较常见，V型淀粉是一种特殊的晶型，一般是由糊化后的淀粉与小分子客体分子络合形成，主要在7°、13°、20°出现衍射峰[18]。图6为糊化后的淀粉、单宁酸、单宁酸沉淀的大米淀粉和糯米淀粉的X射线衍射图谱。糊化后的淀粉的特征峰消失，出现了非晶特性；单宁酸处于无定形状态；单宁酸沉淀的普通大米淀粉与糯米淀粉在7°、13°、20°处均未出现衍射峰，表明单宁酸未与淀粉形成V型复合物。多酚分子可通过疏水作用进入淀粉的空腔内进行特异性结合从而形成V型复合物[18]。而淀粉与单宁酸未形成V型复合物，这表明单宁酸与淀粉可能不存在疏水相互作用。

注：a为糊化后的淀粉；b为单宁酸沉淀的糯米淀粉；c为单宁酸；d为单宁酸沉淀的普通大米淀粉。图6 X射线衍射图谱

2.7 等温滴定量热分析

ITC是表征分子相互作用的最有效的方法之一，可用于研究多酚与蛋白质、多糖等的相互作用，它的优点是能够灵敏的测量配体和聚合物相互作用的焓变化，并提供重要的数据，如结合常数、结合位点、吉布斯自由能、焓值、熵值等。放热或吸热是分子间相互作用的普遍特性，在共价键的形成和非共价键的重组和形成中均可观察到。ITC的基本原理是将配体逐渐滴入大分子(受体)中，同时参比池和样品池的温度保持不变，若在滴定过程中发生相互作用，则会释放或吸收热量，每次滴入后峰面积即为滴定所产生的热量[19,20]。随着反应逐渐完全，受体的结合位点都被占据，峰的高度可能不再变化。本实验中，ITC记录了单宁酸滴入缓冲液(pH 4.0)、普通大米淀粉溶液及糯米淀粉溶液的热流变化。如图7a所示，单宁酸滴入醋酸缓冲溶液中形成了小型的吸热峰，这说明单宁酸的稀释过程是一个吸热反应。而当单宁酸滴入淀粉溶液后，发现该过程焓值变化小于零，该现象说明单宁酸滴入淀粉溶液的过程是一个放热反应；并且放出的热量随着滴入单宁酸的比例增加而减少，这说明淀粉与单宁酸的结合位点在逐渐减少。

普通大米淀粉、糯米淀粉与单宁酸的热量-质量比曲线如图7b、图7c所示，通过对曲线的拟合得到普通大米淀粉、糯米淀粉与单宁酸相互作用的热力学参数。单宁酸与普通大米淀粉结合的化学计量数(N)为(0.64±0.12)，这表明在单宁酸与普通大米淀粉的质量比约为0.64时，普通大米淀粉上的结合位点基本达到饱和，在质量比为0.6处淀粉得率最高；单宁酸与糯米淀粉结合的化学计量数(N)为(0.89±0.16)，说明糯米淀粉分子上的结合位点在两者质量比约为0.89时达到了饱和，与2.1的结果一致，糯米淀粉得率在二者质量比为0.8时最高。普通大米淀粉与单宁酸的结合常数(K)为(357±116)，糯米淀粉与单宁酸的结合常数(K)为(438±172)，结合常数都处于较小水平，这表明两者之间的亲和力较弱。

图7 单宁酸在25 ℃下的等温滴定量热分析曲线

此外，计算发现：普通大米淀粉与单宁酸反应过程中焓值(ΔH)为(-2.04±0.06)cal/g，熵值(ΔS)为1.12 × 10-3cal/(g·K)，吉布斯自由能(ΔG)为-4.13 cal/g；糯米淀粉与单宁酸反应过程中焓值(ΔH)为(-0.98±0.03)cal/g，熵值(ΔS)为0.99 ×10-3cal/(g·K)，吉布斯自由能(ΔG)为-1.28 cal/g。根据Ross的研究，认为混合体系内主要存在两种结合反应：一种是熵驱动反应，即ΔH>0(吸热反应)，ΔS>0(熵增)，TΔS>ΔH，体系中主要是熵效应导致该混合体系内ΔG<0，该反应属于熵驱动，主要驱动力为分子间的疏水作用；另一种反应是以焓驱动为主要推动的焓-熵补偿反应，即ΔH<0(放热反应)，ΔS>0(熵增)，|TΔS|<|ΔH|，体系中熵效应与放热共同导致体系的ΔG<0，该反应的主要驱动力为氢键或静电相互作用[21]。由此可见，单宁酸与淀粉之间的相互作用属于以焓驱动为主的焓-熵补偿的过程，而淀粉属于中性物质。因此，单宁酸与淀粉之间的相互作用力是以氢键为主的非共价相互作用力，且该反应是自发进行的。当多酚与淀粉形成非包合物时，主要通过形成氢键进行相互作用[22-25]，这与本实验结果一致。如Chai等[25]通过XRD发现淀粉分子与茶多酚之间也未形成V型复合物，推测茶多酚可能是以氢键为桥梁与淀粉分子作用 。因此，推测单宁酸沉淀淀粉的机理为：单宁酸与水分子竞争淀粉，并与淀粉分子形成稳定的氢键，从而使淀粉沉淀析出。

3 结论

单宁酸的添加量、沉淀时间、体系pH等因素对单宁酸沉淀淀粉过程有显著性影响；而沉淀温度和金属离子对淀粉沉淀过程无显著影响。淀粉浓度越高，沉淀淀粉所需单宁酸的添加量越大；pH越低，单宁酸沉淀淀粉效率越高；综合实验结果和成本，单宁酸沉淀淀粉的最佳温度为25 ℃，最佳时间为6 h。XRD与ITC分析表明单宁酸可能与水分子竞争淀粉分子形成氢键，从而导致淀粉从水溶液中沉淀析出。