重金属镉及盐胁迫对白榆幼苗生理特性的影响

韩淑敏杨立科布和徐欢周静宇徐燕

(1.内蒙古农业大学 林学院,呼和浩特 010018;2.鄂尔多斯市规划编制研究中心,内蒙古 鄂尔多斯 017100;3.内蒙古师范大学二连浩特国际学院,内蒙古 二连浩特 011100;4.鄂尔多斯市社会保险事业服务中心,内蒙古 鄂尔多斯 017100)

0 引言

近年来,农业和工业飞速发展,各种重金属通过农药化肥、采矿冶金和非法排放污水等不断进入土壤中。有研究表明这些重金属污染对植物和动物造成破坏,甚至通过食物链给人类健康造成危害[1-2]。2014年,环境保护部(现为生态环境部)、国土资源部(现成为自然资源部)联合发布《全国土壤污染状况调查公报》,全国土壤环境状况不容乐观,其中从污染物超标情况看,重金属镉的超标率达到了7.0%[3]。2018年,生态环境部发布《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》(GB 15618—2018),依据农用地土壤污染风险管制值规定,土壤中镉小于等于4.0 mg/kg表明土地污染风险高,原则上应当采取禁止种植食用农产品、退耕还林等严格管控措施[4]。土壤盐碱化是世界性生态环境问题,对于农业、林业生产有着重要的影响[5]。目前盐碱化土地占我国国土面积的1/4,主要集中在东部沿海地区、中西部干旱及半干旱地区[6]。随着经济社会的发展,工业污染问题、气候变化异常和不合理的施肥灌溉等致使土壤盐碱化面积逐年增加[7]。

目前针对土壤复合污染问题,利用植物修复受污染的土壤成为研究和应用热点,具有经济成本低、适应性广和操作简单等优点,对环境恢复功能有明显持久效果[8-9]。曹婧等[10]研究发现,随着锰胁迫梯度不断升高,紫花苜蓿的株高、生物量、酶活性出现先增加后减少的趋势,丙二醛(MDA)含量则呈现上升趋势。朱秀红等[11]研究表明,随着镉胁迫水平质量浓度的增加,白花泡桐的叶绿素含量和过氧化氢酶(CAT)活性出现上升趋势,超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量呈现先升高后降低的趋势,其对复合重金属污染土地具有有效的生态恢复潜力。张晓晓[12]采用土培法,探讨了3个白榆品系对盐胁迫的响应机制。研究表明,3种白榆品系耐盐性阈值均大于155 mmol/L,随着盐胁迫梯度的上升,白榆MDA、可溶性蛋白(SP)含量出现先上升后下降,叶绿素含量随着胁迫增加出现下降的趋势。

白榆(Ulmuspumila)又名家榆,榆科(Ulmaceae)榆属(Ulmus)乔木,属典型的北温带落叶阔叶树种[13],是我国经济和生态价值较高的树种之一,能够有效保持水土保护生态[14-15]。有研究表明白榆对干旱[16]、盐碱[17]及重金属污染[18-20]等有较强的抗性。土壤污染问题并不是单一出现的,更多情况是多种污染源以组合形式出现土壤复合污染[21],目前针对白榆复合重金属胁迫的研究相对较少。本研究利用土培试验,研究不同含量梯度的Cd、NaCl单一及复合胁迫下,白榆的生理生化特性,对修复Cd、NaCl污染土壤提供科学依据,以期探讨白榆经济生态价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年7—9月在内蒙古农业大学林学院一楼温室大棚中进行,试验期间温室大棚内温度为22～35 ℃,相对湿度为50%～60%,试验材料为发育正常生长健壮的1年生白榆苗。

1.2 试验方法

选取长势基本一致的白榆苗共48株,于2021年4月用高30 cm、内径20 cm的塑料花盆进行移栽,栽培基质为营养土和蛭石( 体积比为1∶1)。依据《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》(GB 15618—2018),并结合预试验所得结果设置Cd、NaCl处理质量浓度,其中Cd质量浓度水平分别设置为0 mg/L(CK)、 10 mg/L(C1)、25 mg/L(C2)、50 mg/L(C3);NaCl质量浓度水平分别设置为0 mmol/L(CK)、300 mmol/L(N1)、500 mmol/L(N2)、700 mmol/L(N3);Cd加入NaCl复合胁迫处理为C1N1、C2N1、C3N1、C1N2、C2N2、C3N2、C1N3、C2N3、C3N3;NaCl中加入Cd复合胁迫处理为N1C1、N2C1、N3C1、N1C2、N2C2、N3C2、N1C3、N2C3、N3C3,每个处理3个重复。白榆苗在温室大棚缓苗3个月,日常浇水杀虫每周浇200 mL的Hoagland营养液保持植物正常生长。自土培试验开始,每隔5 d每盆浇200 mL相应水平质量浓度的Cd、NaCl溶液进行重金属胁迫处理,共胁迫60 d。

1.3 测定指标与方法

在胁迫60 d后,取植株相同部位的叶片,进行生理生化指标测定,如:叶绿素、丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)。其中,叶绿素含量测定采用80%丙酮法,称取0.2 g样品,加入少量碳酸钙粉和3 mL的80%丙酮提取液研磨,再加丙酮10 mL继续研磨至组织发白后,放黑暗处静置5 min,用滤纸过滤到25 mL容量瓶最后定容至25 mL,将稀释后叶绿体色素提取液倒入到比色杯内,在663 nm和646 nm波长下测定吸光度;丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法,称取0.3 g样品加入5 mL 5%TCA(三氯乙酸),充分研磨匀浆4 000 r/min离心10 min,取得上清液2 mL加入2 mL0.67%TBA(硫代巴比妥酸)混合后沸水浴30 min,冷却后再次离心10 min,取上清液分别在450、532、600 nm处检测吸光值;过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法,称取样品0.5 g于预冷的研钵中加入5 mL预冷的磷酸缓冲液(0.05 mol/L,pH 7.8),冰浴中充分研磨在4 ℃下8 000 r/min 离心20 min,上清液即为粗酶液。 测定POD的活性时,以加入3 mL反应混合液和1 mL磷酸缓冲液(pH 7.8)的比色皿作为校零对照,以3 mL反应混合液加1 mL上述粗酶液作为试验组。校零后,立即开启秒表计时,于470 nm波长处测吸光度(OD)值,每隔30 s读取一次共读5次。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法,将1.5 mL的0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)、0.3 mL的130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液、0.3 mL的750 μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液、0.3 mL的100 μmol/L EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)液、0.3 mL的20 μmol/L核黄素、0.05 mL的粗酶液及0.25 mL蒸馏水混合后,一支对照管置于暗处,其他试管于4 000 lx日光下反应10 min。反应结束后,以暗处的试管做空白对照,分别在560 nm波长测定其他各管的吸光度。

1.4 数据处理

采用Excel 2016软件整理计算数据;采用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析,其中显著性检验:P＞0.05是无显著相关,P≤0.05是显著相关,P≤0.01是极显著相关;采用Origin 2018软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 Cd、NaCl单一及复合胁迫对白榆叶绿素含量的影响

叶绿素是植物进行光合作用产生的主要色素,在植物光合作用的光吸收中起核心作用,随着植物破坏和逆境加剧,植物内体叶绿素含量变化可作为其抗性研究的主要参考指标。由图1可知,单一Cd胁迫下总叶绿素含量随着Cd梯度增加出现下降趋势,C3下降幅度最大,比对照显著下降了46.22%;单一NaCl胁迫下总叶绿素含量随着NaCl梯度增加比对照出现明显下降趋势,其中N1、N2、N3分别比对照下降了59.20%、70.98%、77.10%,表明NaCl胁迫对白榆总叶绿素含量影响比Cd胁迫效果更显著。Cd、NaCl复合胁迫时,在同一Cd胁迫中添加NaCl对白榆总叶绿素含量影响如图1(a)所示,单一Cd胁迫梯度变化幅度较小,加入N1梯度的Cd胁迫显著低于不添加NaCl的Cd胁迫梯度,其中C1N1比C1梯度下降了62.10%,C2N1比C2梯度下降了62.18%, C3N1比C3梯度下降了51.32%;在同一NaCl胁迫中添加Cd对白榆总叶绿素含量影响如图1(b)所示,Cd胁迫对白榆总叶绿素含量的影响比NaCl胁迫影响小,添加不同梯度的Cd对于NaCl胁迫变化幅度不明显,但仍然能看出下降趋势,其中N1C3比N1梯度下降了35.85%,N2C3比N2梯度下降了31.22%,N3C3比N3梯度下降了40.50%。由此说明,单一Cd胁迫对于白榆总叶绿素含量的影响小于单一NaCL胁迫,随着复合胁迫梯度的增加,白榆总叶绿素含量逐步减少,说明复合土壤污染对白榆生长发育有明显抑制作用。显著性分析表明,Cd、NaCL单一及复合胁迫的组间与组内均有显著差异(P≤0.05)。

图1 Cd、NaCl单一及复合胁迫对桑树总叶绿素含量的影响Fig.1 Effect of Cd, NaCl single and combined stress on the phlorophyll of Ulmus pumila

2.2 Cd、NaCl单一及复合胁迫对榆树MDA含量的影响

MDA是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应产生的氧化终产物,在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是常用的指标。植物器官衰老或者逆境下细胞会损伤,其含量可以反映植物遭受衰老或逆境伤害的程度。由图2(a)可知,单一Cd胁迫下MDA含量随着Cd梯度增加出现上升趋势,但单一Cd胁迫下MDA含量变化不显著,说明Cd对白榆生长发育破坏程度较小。由图2(b)可知,单一NaCl胁迫下MDA含量随着NaCl梯度增加出现较为明显的上升趋势,其中N1、N2、N3分别比对照上升了66.55%、77.57%、86.59%。由图2可知,NaCl胁迫对白榆MDA含量影响比Cd胁迫效果更显著,表明NaCl胁迫比Cd胁迫对白榆伤害程度更高。Cd、NaCl复合胁迫时,在同一Cd胁迫中添加NaCl对白榆MDA含量影响如图2(a)所示,单一Cd胁迫梯度变化幅度较小,加入NaCl梯度的C3胁迫比不添加NaCl梯度的C3胁迫显著上升,其中C3N1、C3N2和C3N3分别比C3梯度上升了57.31%、73.71%、77.66%;在同一NaCl胁迫中添加Cd对白榆总叶绿素含量影响如图2(b)所示,Cd胁迫对白榆MDA含量的影响比NaCl胁迫影响小,添加不同梯度的Cd对于NaCl胁迫变化幅度不明显,但仍然能看出上升趋势,其中N1C2比N1C3梯度上升了28.94%,N2C2比N2C3梯度上升了31.13%。由此说明,单一NaCl胁迫对于白榆MDA含量的影响显著大于单一Cd胁迫,随着复合胁迫梯度的增加,白榆MDA含量逐步增加,说明复合土壤污染对白榆器官细胞有破坏作用,对其生长发育有明显抑制作用。显著性分析表明,Cd单一胁迫的组内显著性差异较小(P＞0.05), NaCl单一胁迫及复合胁迫的组间与组内均有显著差异(P≤0.05)。

图2 Cd、NaCl单一及复合胁迫对白榆MDA含量的影响Fig.2 Effect of Cd, NaCl single and combined stress on the MDA of Ulmus pumila

2.3 Cd、NaCl单一及复合胁迫对白榆POD活性的影响

POD广泛存在于植物体中是一种活性较高的酶,与光合作用、呼吸作用及生长素的氧化反应等都有关系,所以POD是植物老化和逆境生理的常用指标之一。由图3可知,单一Cd胁迫下POD活性随着Cd梯度增加呈先上升后下降的趋势,C2到C3梯度POD活性下降了1.75%。单一NaCl胁迫下POD活性随着CK、N1、N2梯度的增加出现上升趋势,N3梯度时POD活性出现下降趋势,其中N1比对照增加了7.02%,表明POD活性在C2、N2梯度时达到极值后开始降低。Cd、NaCl复合胁迫时,在同一Cd胁迫中添加NaCl对白榆POD活性变化如图3(a)所示,单一Cd和NaCl胁迫梯度变化幅度均较小,加入复合胁迫后POD活性高于单一胁迫梯度,其中C2N2的POD活性值最高比C2梯度升高了19.14%。由3(b)可知,在同一NaCl加入Cd的复合胁迫中,N2C3到N3C3梯度降低了9.25%。由此说明,POD活性变化在Cd、NaCl单一及复合胁迫的组内变化趋势较典型,分别在第1到第3梯度有显著上升,到第4梯度时出现下降,证明第3梯度为 POD活性的极值,且复合胁迫对于POD活性变化幅度大于单一胁迫,说明复合土壤污染对白榆的酶活性有更大的影响,对白榆生长发育有明显抑制作用。显著性分析表明, Cd、NaCl单一及复合胁迫的组间与组内均有显著差异(P≤0.05)。

图3 Cd、NaCl单一及复合胁迫对桑树POD活性的影响Fig.3 Effect of Cd, NaCl single and combined stress on the POD of Ulmus pumila

2.4 Cd、NaCl单一及复合胁迫对白榆SOD活性的影响

图4 Cd、NaCl单一及复合胁迫对桑树SOD活性的影响Fig.4 Effect of Cd, NaCl single and combined stress on the SOD of Ulmus pumila

SOD是生物体内重要的抗氧化酶,广泛存在于动物、植物和微生物等大量生物体内,植物损伤、衰老及逆境等决定着SOD在生物体内的活性高低,所以SOD活性水平是植物抗氧化机制的重要反应也是逆境生理的常用指标之一。由图4可知,单一Cd胁迫下SOD活性随着CK、C1、C2梯度的增加出现上升趋势,C3梯度时SOD活性出现下降趋势,其中CK到C1梯度SOD活性上升了166.67%,C2到C3梯度SOD活性下降了18.19%;单一NaCl胁迫下SOD活性变化与单一Cd胁迫变化幅度相同,NaCl随着质量浓度增加出现先上升后下降的趋势,其中N1到N2的增幅最大,增加了80.00%,表明SOD活性在C2、N2质量浓度水平时达到极值从C3、N3梯度出现降低趋势。Cd、NaCl复合胁迫时,在同一Cd胁迫中添加NaCl对白榆SOD活性变化如图4(a)所示,加入NaCl梯度的Cd胁迫SOD活性水平高于不添加NaCl的Cd胁迫梯度,其中添加N2梯度的Cd胁迫SOD活性水平最高,C1N2比C1升高了290.63%,C2N2比C2显著升高了265.23%,C3N2比C3升高了306.94%;在同一NaCl胁迫中添加Cd对白榆SOD活性变化趋势如图4(b)所示,添加C2梯度的NaCl胁迫变化幅度最大,其中N1C2比N1升高了489.25%,N2C2比N2升高了346.39%,N3C3比N3升高了134.38%。由此说明,SOD活性水平变化在Cd、NaCl单一及复合胁迫的组内及组间变化趋势较显著,分别在第1到第3梯度有大幅上升,到第4梯度时出现下降趋势,证明第3梯度时达到SOD活性的极值,且复合胁迫对于SOD活性变化幅度大于单一胁迫,说明复合土壤污染对白榆的抗氧化酶有更大的响应,对白榆生长发育有明显抑制作用。显著性分析表明,Cd单一胁迫的组内显著性差异较小(P＞0.05), NaCl单一胁迫及复合胁迫的组间与组内均有显著差异(P≤0.05)。

Cd、NaCl单一及复合胁迫实验过程中,白榆幼苗随着时间推移叶片和根系表型发生不同变化。总体上白榆叶片表型变化是复合胁迫最明显,其次是NaCl胁迫最后是Cd胁迫。60 d后N3C3、N2C2梯度白榆幼苗叶片全部枯黄发干叶片掉落明显,其他梯度的复合胁迫叶片发黄叶片边缘出现干皱的现象,NaCl胁迫下白榆随着质量浓度变化叶片逐步呈灰黄色且掉落明显,Cd胁迫下叶片表型变化不显著,只有C3梯度叶片有明显发黄掉落,CK、C1及C2梯度叶片均呈现健康的深绿色且叶片中含有水分无明显掉落现象。

3 讨论

叶绿素含量是判断植物进行光合作用的重要指标,叶绿素含量的变化能够体现植物对逆境胁迫环境的适应性[22-23]。李欣航等[24]研究结果表明,随着Mn胁迫梯度增加鸡眼草叶绿素含量逐步降低,高质量浓度的Mn会破坏叶绿体的结构阻碍叶绿素的合成,从而导致叶绿素含量的降低,影响其光合作用,与本试验的结果一致。Cd胁迫会破坏白榆叶片中叶绿体结构,降低叶绿素的含量,阻碍植物正常发育生长,与孙博文等[25]、张金彪等[26]的研究相吻合。在本试验中,NaCl胁迫对白榆叶片的破坏程度高于Cd胁迫,在Cd、NaCl复合胁迫中叶绿素含量也出现逐步降低的趋势,其中N1C1、N1C2、N1C3分别比C1、C2、C3的叶绿素含量出现大幅下降,表明N1梯度对植物光合作用的影响最大,抑制了叶绿素合成,总体来说,Cd、NaCl复合胁迫的叶绿素含量显著低于同一梯度的单一Cd胁迫。

丙二醛(MDA)是植物细胞膜脂过氧化作用的最终产物,通过植物膜脂过氧化程度的高低来判断植物在逆境中的伤害程度,MDA含量与膜脂过氧化程度呈正相关,即胁迫梯度越高MDA含量越高。周慧等[27]研究表明随着重金属Cd质量浓度的升高,5种湿生观赏植物的MDA含量均呈现不同程度的升高,说明由于重金属胁迫5种湿生植物的细胞膜脂过氧化反应明显,造成不同程度的伤害,与本研究结论一致。胡博等[28]研究发现,盐胁迫对不同种源的桑树也有显著影响,其MDA含量由鸡桑到龙桑到蒙桑逐步增加,随着盐质量浓度的升高及时间的延长,不同种源桑树无法抵御盐胁迫的伤害,证明盐胁迫对不同种源的桑树细胞结构均产生破坏,导致MDA含量的增加。本试验中白榆随着单一Cd、单一NaCl及Cd、NaCl复合胁迫作用下MDA含量逐步升高,表明其破坏程度从大到小为:Cd、NaCl复合胁迫、单一NaCl胁迫、单一Cd胁迫。

POD能够将植物体内的H2O2分解为O2和H2O,从而使植物体的H2O2清除免受植物老化和逆境生理的伤害作用[29]。POD与植物的光合作用、呼吸作用等氧化反应息息相关,因此作为本试验的生理指标之一。孟长军[30]研究表明随着铝胁迫梯度增加,白苦瓜幼苗叶片中的POD活性水平呈现先增加后降低的趋势,在100 mg/L的铝胁迫梯度下POD活性水平达到最高峰,随着铝胁迫质量浓度增加,白苦瓜幼苗的POD活性水平显著低于对照。这与本实验研究结果一致,单一Cd、NaCl及复合胁迫下,POD活性在第3梯度时达到最高值,在第4梯度时出现下降,且复合胁迫对于桑树POD活性影响高于单一胁迫。在一定质量浓度下,白榆通过增加POD活性稳定细胞膜结构来响应逆境胁迫对植物抗氧化系统的损害,但达到更高质量浓度时,维稳能力逐渐丧失,POD活性随之出现下降趋势。这与许爱祝等[31]对于麻疯树幼苗根系重金属抗逆性研究结果一致,当Cu质量浓度达到200 mg/L时,麻疯树幼苗根系POD值降到最低,植株基本死亡。

SOD防御超氧阴离子自由基对植物细胞的破坏,保护植物细胞在老化、损伤及逆境时免受氧化损伤[32]。柯野等[33]研究低磷胁迫对甘蔗SOD活性有显著影响,随着低磷胁迫梯度变化,SOD活性逐步升高,其主要原因是低磷胁迫下甘蔗内会产生大量的活性氧自由基,刺激SOD活性增强以防御超氧阴离子对植物内部的破坏,从而提高甘蔗对逆境的防御能力,减少对植株的伤害。但SOD活性只能在一定范围内有效去除重金属对植物细胞的损伤,随着逆境环境加重,SOD活性会逐渐下降。这与周洋等[34]关于轮叶黑藻在铅锌胁迫下的生理响应研究结果不一致,轮叶黑藻随着重金属梯度的增加SOD活性水平出现持续上升趋势,可能是由于重金属胁迫质量浓度的持续升高导致活性氧自由基出现紊乱现象,无法抵御超氧阴离子自由基,超氧化物歧化酶遭到破坏。

综上所述,Cd、NaCl复合胁迫对白榆的叶绿素含量、MDA含量、POD活性及SOD活性等生理特性比单一Cd、NaCl胁迫的胁迫作用更大;单一Cd、NaCl胁迫处理下,单一NaCl胁迫对白榆的叶绿素含量、MDA含量及POD活性水平比单一Cd胁迫胁迫作用更大;Cd、NaCl单一及复合胁迫处理下,白榆POD活性和SOD活性表现为低质量浓度上升高质量浓度下降的趋势; Cd胁迫水平在0～200 mg/L范围内,NaCl胁迫水平在0～500 mmol/L范围内白榆POD活性与SOD活性呈上升趋势,植物能正常生长有效抗逆,高于此质量浓度后白榆POD活性与SOD活性出现下降趋势,证明植物达到抗逆性的极值。