果树微芽嫁接技术研究进展

李 根，何 斌，张 成，王 强，朱文杰，杨永波，陈媛媛，肖欣娟

(成都市农业技术推广总站，四川 成都 610041)

微芽嫁接又称茎尖嫁接，是组织培养与嫁接相结合的一种培育无毒嫁接苗的技术[1]。即在无菌条件下切取样品的微小茎尖嫁接到组培繁育出的砧木苗上，给予适宜的培养条件，最终愈合发育成完整植株，以达到脱毒的效果。由于病毒在植物体中是通过维管束和胞间连丝传播，而植物茎尖分生区细胞活跃，细胞分裂速度极快，且没有维管束，病毒传播受限且速度跟不上细胞分裂速度，因此，茎尖中病毒含量极低，可通过微芽嫁接技术获得脱毒植株。

Murashige等在1972年建立微体嫁接技术，并在1975年得到Navarro等的改进[2]，近年来，由于微芽嫁接技术较高的脱毒率，且嫁接植株环境条件可控，该技术已在柑橘、猕猴桃、桃等果树研究中广泛应用，例如Navarro等在1981年采用此法成功培育出无病毒的柑橘母本树，并建立柑橘母本园，广泛应用在西班牙柑橘产业中，极大的提高了当地柑橘的产量和质量。由于大多果树均为多年生，且通过嫁接进行繁育，田间材料获取周期长，且环境不可控，接穗材料大多在实验室组培条件下又难以直接生根繁育，因此，微芽嫁接技术还能解决果树研究中嫁接材料获取难的问题，在较短的周期内，获得条件可控的组培嫁接材料，应用于某些研究中。

1 微芽嫁接技术在果树研究中的应用

1.1 嫁接亲和性的鉴定

近年来，由于果树接穗及砧木新品种选育进程加快，嫁接亲和性研究对于新品种在生产中应用极为重要，通过田间常规嫁接进行亲和性研究，周期长，环境因素影响较大，且部分嫁接组合的不亲和需要几个月乃至几年时间才能完全表现出来。因此，微芽嫁接技术可作为嫁接亲和性研究的储备技术，解决环境因素不可控、研究周期长等问题。

1.2 植物病毒快速检测

目前，在果树上常用的病毒检测方法一般为木本指示检测法，由于果树多年生的特性，部分果树童期较长，因此，该方法检测周期较长，一般达到2年以上，才能成功鉴定出无病毒苗木，限制了无毒苗木产业的发展和扩大。近年来，由于微芽嫁接技术的快速发展与应用，结合该技术的植物病毒快速检测法在无毒苗木的鉴定与繁育中广泛应用，既缩短了检测周期，又加快了果树无毒苗木的繁育。例如在葡萄上已有研究并成功应用，研究者以微芽嫁接技术结合组培的方式培育带葡萄扇叶病毒的嫁接植株，培育2～3个月后葡萄嫁接苗即出现病症，且病毒检出率近80%，通过进一步的条件优化和改良，检出率会进一步提高。

1.3 无毒苗木的快速繁育

目前，各类果树中优质主栽品种中，存在较多难以生根的品种，只能通过嫁接繁育。在生产中繁育苗木一般通过播种砧木种子，获得实生砧木苗，嫁接优质品种的接穗，达到繁育的目的。该方法对接穗和砧木苗的质量要求较高，同时嫁接时间具有一定的局限性。微芽嫁接技术中，优质无毒茎尖及暗培养的砧木黄化苗较易获得，以微芽嫁接的方式可以获得大量的无毒嫁接苗木，不仅更好的解决了优质品种难以生根的问题，且随时可以获得适宜的嫁接环境进行嫁接，可加快无毒苗木的繁育速度。

1.4 砧穗互作研究

近年来，砧穗互作研究成为了果树领域的热门，通过砧穗互作的研究，可以直观的揭示果树在嫁接亲和性、生理生长、信号传导及调控、长距离运输等方面相关的相关机理。通过微芽嫁接技术能够较快的获得嫁接植株材料，且不受外界环境的影响，植株材料也可根据不同的研究方向进行相应的处理。除传统的田间试验外，实验室内可控的外部环境以及较短的培养周期，让微芽嫁接技术成为了砧穗互作研究的“敲门砖”。

2 影响嫁接成活率的因素

2.1 砧木和接穗

不同的砧木和接穗及其亲和性对于微芽嫁接成活率有较大影响，亲缘关系较近、亲和性较好的嫁接组合嫁接成活率一般较高。Lahoty等[3]使用卡里佐枳橙等3种砧木嫁接“那格浦尔”柑橘进行微芽嫁接技术研究，发现各嫁接组合成活率差异较大，以卡里佐枳橙为砧木嫁接成活率最高。此外，砧木的生长状态也会影响嫁接成活率。目前多数研究认为砧木苗龄为10～18d时，微芽嫁接的成活率最高。但也有研究[4]认为砧木苗龄只代表砧木的生长时间，并不能体现出砧木的生长状态，且会受到种子质量、消毒方式和温度等的影响。所以也有研究认为砧木苗龄与微芽嫁接成活率的关系不大。

2.2 茎尖大小

微芽嫁接的成活率与茎尖的大小成正相关，而病毒的脱除率与茎尖的大小成负相关。Singh等[5]研究发现茎尖大小由0.2mm增加到0.5mm，嫁接成活率由30.55%增加到41.66%。茎尖大小0.2mm时脱毒率为100%，而0.3mm时脱毒率仅为20%，大于0.3mm则不能脱除印度柑橘环斑病毒(ICRSV)。茎尖大小除了以长度衡量外，叶原基数量也是重要的衡量指标。有研究发现茎尖小于2个叶原基，微芽嫁接成活率极低。当茎尖大于4个叶原基，则难以脱除病毒，因此微芽嫁接时茎尖切取的大小应为2～3个叶原基[6]。

2.3 嫁接方法

微芽嫁接的常见方法有7种，包括倒T形法、顶接法、嵌芽腹接法、点接法、△形法、⊥压法和横压法。研究表明不同的嫁接方法对于微芽嫁接成活率具有较大的影响，有些方法成活率高但操作较为复杂，而有些方法成活率稍低但操作简单、快捷，因此需针对不同的实验情况选择适宜的方法[7]。

2.4 培养条件

研究表明微芽嫁接所用的砧木材料为暗培养的黄化苗时，能提高微芽嫁接的成活率，且嫁接后的试管苗需在特定环境中进行培养[8]。砧木试管苗先暗培养14d，此时的砧木黄化苗能与接穗更好地结合，从而提高嫁接成活率。此外，植物激素的使用同样影响嫁接成活率。刘柏玲等[9]在微芽嫁接实验中使用不同浓度的6-BA和GA3对德尔塔夏橙、纽荷尔脐橙等8个品种柑橘进行了处理，结果显示不同激素对不同品种的嫁接成活率差异明显，且使用植物激素进行预处理的嫁接成活率均高于使用蒸馏水进行预处理的对照。

3 总结与展望

微芽嫁接技术自1972年建立以来，经过研究者们多年的探索与改进，目前该项技术已经较为成熟和完善，应用程度较高，特别是在果树上。微芽嫁接技术主要应用于嫁接亲和性的鉴定、植物病毒快速检测、无毒苗木的快速繁育，此外，还可应用于细胞学、分子生物学的某些研究体系中。通过一些生物技术结合微芽嫁接技术，可以解决果树育种及生产问题，同时还可能实现果树优良种质的创造，如通过对柑橘微芽嫁接材料进行辐射诱变育种，可以极大的提高基因突变频率，通过筛选出其中的小量突变，在改良品种的同时又可保证原有品种的优良性状。影响嫁接成活率的因素除文中所述的四点外，还包括砧木和接穗的亲和性、茎尖采集的季节及气候条件等[10]。如在夏季7-8月，由于气候高温干燥，抑制了细菌的繁殖，因此，进行微芽嫁接时污染率较低。柑橘在春季由于花芽迅速萌发，与新梢形成了营养竞争关系，茎尖生理活性下降；秋季温差变化加大，接穗生理活性降低，因此嫁接成活率也会降低。综上，在夏季取柑橘茎尖，嫁接成活率最高，污染率也较低。

目前，微芽嫁接技术已较为成熟，但因其材料、嫁接操作和培养条件要求较为严格，因此该技术培养嫁接离体材料的效率相比于传统的离体培养技术仍偏低，除已知的影响因素外，研究者们可进一步针对其他影响因素进行控制性实验，以期进一步优化该技术。此外，除了应用在传统的大宗果树外，还可适当应用于部分小宗果树，拓展研究领域，针对其生理生化特性进行探索和尝试。