海绵动物天然产物提取及其抑菌活性分析

◇海南热带海洋学院生态环境学院 刘书伟 王 燕 张田田

为探索海绵动物天然产物的抑菌效果，以70%乙醇为提取溶剂，使用热回流法提取海绵乙醇总浸膏，以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇为萃取液依次萃取总浸膏，采用KB法开展萃取物抑菌试验。结果显示，乙醇总浸膏提取率为5.3545%±0.4702%，各萃取物的质量不同，其大小顺序为石油醚＞二氯甲烷＞乙酸乙酯＞正丁醇。不同的萃取物对3种菌的抑制效果不同，石油醚萃取物对金黄色葡萄球菌抑制效果较好，5个浓度均达到中敏状态，最大抑菌直径为12.22mm±0.52mm；二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物对枯草芽孢杆菌抑制效果较好，其中乙酸乙酯萃取物对枯草芽孢杆菌抑制效果更为突出，5个浓度均达到中敏状态以上，且在40、50mg/mL浓度时，达到了高敏状态，最大抑菌直径为17.35mm±0.54mm；正丁醇萃取物对3种菌不敏感。该实验可为海绵动物天然产物的开发提供理论支撑。

海洋是生命的摇篮，也是巨大药物宝库，海洋生物因其生存在高盐、高压、缺氧、低温、低营养、无光照以及局部高温等特殊生态环境中，促使其在生长和代谢过程中，产生并积累了大量具有特殊化学结构并具有特殊生理活性及功能的物质，为海洋药物研究和开发提供大量的新材料[1]。海绵动物是仅次于珊瑚的第二大海洋底栖生物，具有丰富的生物多样性，被认为是天然产物的重要来源[2]，据报道，从海洋无脊椎动物中分离出1.5万多种海洋天然产物中30%以上来自海绵[3]，尤其是具有细胞毒性的化合物超过10%，显著高于其他海洋动物、陆生植物和微生物[4]，为新药研制提供了大量高活性的先导化合物，目前海绵已成为海洋生物中研究最积极的领域之一[5]。海绵天然产物主要包括生物碱、聚酮类化合物、萜类化合物、肽类、芳烃类、类萜类、大环内酯类、类固醇类和卤代化合物[6-8]等物质，该类物质表现出丰富的化学多样性，并且显示了较好的生物活性，如抗菌活性、抗癌活性、抗病毒活性、抗炎活性、防污活性和抗氧化活性[9-10]等。海绵动物的抑菌活性是海绵天然产物的一个重要研究领域，本试验通过对海绵动物天然产物的提取和萃取，进一步探索海绵动物天然产物的抑菌活性，为抑菌药物的开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

海绵动物材料采自海南省陵水黎族自治县新村潟湖及其新城镇附近海域。石油醚（AR）、二氯甲烷（AR）、乙酸乙酯（AR）和无水乙醇（AR）购自西陇科学股份有限公司。

1.2 试验方法

（1）海绵动物乙醇提取物的制备、萃取及抑菌液配制。取100g左右干燥海绵动物，剪成小块，用70%的乙醇热回流提取。乙醇提取物依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到相应的萃取物。将4种萃取物与无菌水分别配置成浓度为10、20、30、40、50mg/mL的溶液，将阳性对照四环素配制成10mg/mL的溶液，以上溶液均采用0.22μm的除菌过滤膜过滤，用于抑菌实验。

（2）菌液制备。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌活化并在LB液体培养基中培养，将细菌离心沉淀后用无菌PBS稀释至浓度为1×108CFU/mL，备用。

（3）抑菌圈直径测定。采用Sofyanita E N[11]的方法并稍作修改，即纸片扩散法（K-B法），无菌条件下向直径为9cm的培养皿中加入 25mLLB琼脂培养基，冷却凝固后把100μL菌液均匀涂抹在培养基表面待用。将直径为6mm的滤纸片灭菌烘干后，采用十字交叉法放置于培养基上，轻压滤纸片使其与培养基完全接触。然后将2μL萃取物溶液滴加到滤纸片上，置于37℃环境下培养24 h，测量抑菌圈直径。

（4）数据统计。利用SPSS19.0软件和Microsoft Excel 2010软件对数据进行统计分析，所有实验均设置3个重复。

2 试验结果与分析

2.1 海绵动物乙醇提取物的萃取量分析

表1显示，海绵动物的乙醇提取物（总浸膏）的提取量较低，每100g样品中获取总浸膏为5.3765g±0.4730g，占样品质量的5.3545%±0.4702%；采用4种溶剂对乙醇总浸膏的萃取量也较低，萃取量最大的为石油醚层萃取物，占总浸膏质量的5.8569%±0.2271%，最低的为正丁醇萃取物，占总浸膏质量的0.6566%±0.0668%，萃取量大小顺序为石油醚＞二氯甲烷＞乙酸乙酯＞正丁醇；在萃取过程中的损失量占总浸膏的0.0044%±0.0009%。

表1 各提取物的质量及其百分比

2.2 海绵动物总浸膏的萃取物的抑菌活性分析

（1）石油醚萃取物抑菌活性。抑菌圈直径大小反映出提取物抑菌的活性状况，抑菌圈直径越大，抑菌效果越明显，本试验采用抑菌圈直径大小判断抑菌强度[12]：极敏状态，Φ≥20mm；高敏状态20＞Φ≥15mm；中敏状态15＞Φ≥9mm；低敏状态9＞Φ≥7mm；不敏感，Φ＜7mm。表2显示，在试验所采用的3种菌中，石油醚萃取物抑菌效果最好的菌种为金黄色葡萄球菌，在浓度为10mg/mL时已达到中敏状态；其次是枯草芽孢杆菌，在浓度为10mg/mL时为低敏状态，浓度大于20mg/mL时均达到中敏状态；对大肠杆菌的抑制效果最差，浓度在30、40、50mg/mL才达到低敏状态。在每个浓度中，对3种菌的抑菌效果差异性均达到显著水平（p＜0.05），在浓度为10mg/mL时差异性达到极显著水平（p＜0.01）。此外，抑菌效果均低于阳性对照。

表2 不同浓度石油醚萃取物的抑菌圈直径（mm）

（2）二氯甲烷层萃取物抑菌活性。表3显示，在试验所采用的3种菌中，二氯甲烷萃取物抑菌效果最佳的菌种为枯草芽孢杆菌，仅在10mg/mL浓度时为不敏感，在20mg/mL浓度时为低敏状态，其他浓度均为中敏状态；其次是金黄色葡萄球菌，10mg/mL浓度不敏感，其他浓度均为低敏状态；5个浓度水平对大肠杆菌均不敏感。二氯甲烷萃取物对三种菌的抑菌效果差异性方面，在30、40、50mg/mL浓度时，差异性均达到极显著水平（p＜0.01），在10mg/mL浓度时，差异性不显著水平（p＜0.05）。二氯甲烷萃取物抑菌效果整体低于石油醚萃取物，且均低于阳性对照。

表3 不同浓度二氯甲烷萃取物的抑菌圈直径（mm）

（3）乙酸乙酯层萃取物抑菌活性。表4显示，在试验所采用的3种菌中，乙酸乙酯萃取物抑菌效果最佳的菌种为枯草芽孢杆菌，5个浓度抑菌效果均达到中敏状态以上，在40、50mg/mL浓度时，均达到了高敏状态；其次是大肠杆菌，在30、40、50mg/mL浓度时达到中敏状态，在20mg/mL浓度时为低敏状态，仅在10mg/mL浓度时不敏感；效果最差的是金黄色葡萄球菌，5个浓度对该菌均不敏感。乙酸乙酯萃取物对三种菌的抑菌效果差异性方面，枯草芽孢杆菌与其他两种菌相比，抑菌效果差异均显著（p＜0.05），且均达到极显著水平（p＜0.01）。尽管乙酸乙酯萃取物对枯草芽孢杆菌抑制效果很不错，但也低于阳性对照。

表4 不同浓度乙酸乙酯萃取物的抑菌圈直径（mm）

（4）正丁醇层萃取物抑菌活性。表5显示，在试验所采用的3种菌中，正丁醇萃取物抑菌效果均不理想，5个浓度抑菌效果均为不敏感，且抑菌效果差异均不显著（p＞0.05），所以，海绵动物乙醇提取物的各层萃取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果较差，不具有统计学意义。

表5 不同浓度正丁醇萃取物的抑菌圈直径（mm）

3 结论

（1）乙醇总浸膏占样本质量的百分比较低，仅为（5.3545±0.4702）%；乙醇总浸膏的萃取物质量差异较大，其大小顺序为石油醚＞二氯甲烷＞乙酸乙酯＞正丁醇。

（2）石油醚萃取物对金黄色葡萄球菌抑制效果优于其他3种萃取物对该菌的抑制效果，5个浓度均达到中敏状态；二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物对枯草芽孢杆菌抑制效果优于对其他两种菌的抑制效果，且乙酸乙酯萃取物抑制效果更突出；正丁醇萃取物对三种菌抑制效果都很差，都属于不敏感的范畴。

（3）4种萃取物对3种菌的抑制效果表现最突出的是乙酸乙酯萃取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果，5个浓度均达到中敏状态以上，其中在40、50mg/mL浓度时，达到了高敏状态。