高效液相色谱法同步测定水产品中 3种四环素类抗生素残留量

◎ 赵宇英

（厦门市食品药品质量检验研究院，福建 厦门 361012）

土霉素、四环素、金霉素同属天然四环素类（Tetracyclines，TCs）药物，长期使用有较大的毒副作用，因此检测食品中的土霉素、四环素、金霉素的残留量就显得尤为重要。目前的检测方法主要包括微生物法[1]、高效液相色谱法[2-3]、液相色谱-质谱法[4]、酶联免疫法[5]等。其中，高效液相色谱法和液质联用法是现阶段实验过程中的首选方法。和质谱检测器相比，由于TCs有很好的紫外吸收特性，在酸性溶液中的紫外最大吸收波长一般在350～380 nm，干扰较少；此外，紫外检测器不仅能够满足残留检测的要求，且分析成本更低[6]。因此，本文研究在现有的液相色谱法基础上，以鱼、虾样品为研究对象，优化针对水产品样品中四环素类抗生素的定量、定性分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土霉素（纯度96.5%）、四环素（纯度96.2%）、金霉素标准品（纯度92.5%）；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯）；实验室用水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

Waters2695高效液相色谱仪+紫外检测器，美国Waters公司；MV5全自动氮吹浓缩仪，北京莱伯泰科LabTech仪器有限公司；预处理柱（Oasis HLB柱）、色谱柱（XBridge BEH C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），美国Waters公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液的配制：用甲醇溶解配制浓度为100 mg·L-1的土霉素、四环素标准储备液，浓度为200 mg·L-1的金霉素标准储备液。

标准曲线的配制：用乙腈+0.1%甲酸水溶液（2+8）配制成土霉素、四环素含量为0.05 μg·mL-1、 0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1和1.00 μg·mL-1， 金霉素含量为0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1、0.40 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1和2.00 μg·mL-1的混合标准溶液。

1.3.2 色谱条件

柱温：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：5 μL；流动相：乙腈（A）和0.1%甲酸水（B）；梯度洗脱；检测波长：355 nm。

1.3.3 样品前处理

（1）样品的制备。该实验样品分别为Sam-1（虾，去头去壳，取可食用肌肉部分）、Sam-2（生鱼肉，去鳞去皮沿背脊取肌肉），充分捣碎均质。

（2）样品的提取。称取5.0 g制备后的样品于50 mL聚乙烯离心管中，依次加入20 mL、20 mL、10 mL的0.1 mol·L-1Na2EDTA-Mclvaine缓 冲 溶 液 冰 水 浴超 声提取3次，每次10 min，并涡旋振荡提取3 min后在 4 ℃，13 000 r·min-1条件下离心3 min，合并上清液定容至50 mL，再次离心后经滤纸过滤，准确吸取上述提取液5.0 mL待固相萃取柱（Oasis HLB）净化。

（3）样品的净化。依次以5 mL甲醇和5 mL实验用水活化Oasis HLB柱后，将上述5.0 mL提取液上样，再用5 mL蒸馏水、5mL 5%甲醇水溶液进行淋洗，抽干后，用5 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液在40 ℃氮吹浓缩至干，用1.0 mL流动相溶液复溶，涡旋混匀上机测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

本研究采用了XBridge BEH C18液相色谱柱，提取溶剂为Na2EDTA-Mclvaine缓冲溶液，设计了3组流动性体系：乙腈∶0.1%甲酸水溶液（20∶80，梯度洗脱）、乙腈∶0.048%的磷酸溶液（20∶80，梯度洗脱）、乙腈∶0.01 mol·L-1磷酸二氢钠溶液（20∶80，等度洗脱）。各体系的色谱图详见图1～图3（TMS、SHS、JMS分别代表土霉素、四环素和金霉素）。

由图1～图3可知，以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相的色谱峰型尖峭，无杂峰，且具有良好的线性关系，相关系数均达到0.999以上；以乙腈和0.048%的磷酸溶液为流动相，对称性不佳，有杂峰，分离效果不好，出现干扰，相关系数达到0.995；以乙腈和 0.01 mol·L-1磷酸二氢钠溶液为流动相等度洗脱，只有3个浓度较高的有响应，方法的灵敏度达不到要求。

图1 乙腈和0.1%甲酸水溶液梯度洗脱色谱图

图3 乙腈和0.01 mol·L-1磷酸二氢钠溶液等度洗脱色谱图

图2 乙腈和0.048%的磷酸溶液梯度洗脱色谱图

2.2 前处理条件的优化

本次研究选择乙腈和0.1%甲酸水溶液作为流动相体系，结果显示Na2EDTA-Mclvaine缓冲溶液的提取效果最好，其中虾样品回收率为85.2%～91.5%，鱼样品回收率为87.0%～94.0%；甲醇溶液作为提取试剂，虾样品回收率在25.2%～32.0%，鱼样品回收率在23.5%～43.0%；磷酸盐缓冲溶液作为提取试剂，虾样品回收率在23.2%～33.0%，鱼样品回收率在29.2%～35.5%。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性范围、检出限

本研究采用基底外标法对目标化合物进行定量分析。结果显示3种四环素类抗生素在一定的浓度范围内线性关系良好，具体情况详见表1。

表1 3种四环素类抗生素的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限表

2.3.2 回收率和精密度

在最优前处理方法以及液相色谱条件下检测，各化合物加标回收和相对标准偏差测定结果如表2所示。3种四环素类抗生素在虾、鱼阴性样品的高、中、低3个加标水平浓度下的加标回收率为85.5%～105.0%，RSD为1.2%～3.1%。

3 结论

本研究选择鱼和虾作为样本，通过实验优化了水产品中土霉素、四环素、金霉素残留的高效液相色谱-紫外检测器分析方法。该方法操作简便、灵敏度高、回收率好，能够满足水产品中土霉素、四环素、金霉素残留量检测的要求，并且更加经济环保。