酱油中可培养抗逆微生物研究进展

◎ 杨 勇，赵阳娟，刘 希，童 星

（1.广东海天创新技术有限公司，广东 佛山 528000；2.佛山市海天调味食品股份有限公司，广东 佛山 528000；3.佛山市海天（高明）调味食品有限公司，广东 佛山 528511）

酱油是一种美味的传统调味品，两千多年前古代中国人民就掌握了酱油的生产酿造方法，从此以后它与人们的生活息息相关。酱油发酵是一个多种类微生物（包括霉菌、酵母、细菌等）共同对大豆和小麦等原料进行天然发酵的过程。经过微生物及其所产酶系的长期、共同作用，使得酱油具有独特的风味和丰富的营养价值[1]。

微生物群落组成对于酱油的发酵过程和风味物质合成具有重要影响，传统酱油发酵过程中微生物的多样性赋予其独特的酯香味和酱香味，然而酱油中食盐、酒精等物质含量较高，严重威胁微生物生长，本文总结了近年来国内外对酱油抗逆微生物的分离鉴定成果，希望为酱油的创新研究工作提供思路，为扩充酱油酿造微生物种质资源库和改善酱油风味提供帮助。

1 酱醪中的主要微生物

从酱油生产中分离得到的微生物种类繁多，主要有霉菌、酵母菌以及细菌（主要是乳酸菌）3大类。酱油制曲阶段主要是霉菌（最主要是米曲霉Aspergillus oryzae）起作用，它在酱油酿造中起到重要作用。酵母菌在酱油发酵过程中主要起增香作用，由此增加了酱油风味。乳酸菌能产生大量的有机酸。有机酸的大量存在不仅对有害微生物的生长有一定的抑制作用，同时为鲁氏接合酵母的生长繁殖提供条件，而且这些有机酸既是酱油的风味成分，又是其他酯香类物质的前体，极大地丰富了酱油风味[2]。

近年来，有国内外学者通过宏基因组学等分子生态学的方法研究了酱醪中微生物的结构组成，发现还有大量其他未被报道的微生物，尤其是大量的细菌参与酱油发酵。研究结果显示，这些细菌的种群总量多、丰度大，但是它们在酱油生产中具有的特性和功能尚不十分清楚[3]。

我国目前的酱油生产商品化菌种资源相对匮乏，无法解决随着生活水平的提高，人们对酱油产品个性化的需求和健康、天然的品质要求也在逐渐增加这一矛盾[4]。而对于研究者而言，就应该不断去发现酱油生产过程中的微生物以及探究它们在发酵过程中的功能角色。

2 依赖于传统培养的方法分离酱油抗逆微生物

综合前期的研究发现，早期酱油抗逆微生物的分离鉴定研究重点在于霉菌和酵母，而对生产过程中存在的耐盐细菌研究相对较少[5]。近年来，随着国内外学者对酱油生产中微生物群落结构研究的逐步深入，发现其中的微生物不仅生物量大而且种类丰富，然而它们在酱油高盐逆境中具有的功能有待进一步研究。目前国内外学者不断报道分离自酱油抗逆微生物以及它们的生物学功能，这对酱油生产微生物菌种库的扩充、对其他进行类似研究的学者们是一种鼓励。

2.1 抗逆细菌

表1对近年来国内外学者从酱醪中分离鉴定的微生物进行了统计。

表1 酱油发酵过程中分离鉴定的耐盐微生物表

从表1各文献中可以看出，不同产地、不同生产方法、不同发酵时间、甚至是不同批次的酱醪中分离得到的抗逆细菌是不尽相同的。各地学者分离鉴定到的抗逆细菌有Weissella（W. paramesenteroides）、Pediococcus（P. halophilus、P. acidilactici、P. pentosaceus）、Staphylococcus（Staph. kloosii、Staph. gallinarum、Staph.condimenti、Staph. cohnii、Staph. vitulus、Staphy. saprophyticus、Staph. epidermidis、Staph. xylosus）、Tetragenococcus（T. halophilus）、Enterococcus（E. faecium）、Bacillus（B. amyloliquefaciens、B.licheniformis、B. pumilus、B. subtilis、B. sonorensis、B. cereus、B. methylotrophicus）、Micrococcus、Aerococcus、Lactobacillus（L. fermentum、L. acidipiscis、L. farciminis、L. pentosus、L. plantarum）、Delftia（D.tsuruhatensis）和coryneform bacteria等。其中大多数分离到的抗逆微生物均未能考察其在酱油生产中的功能。YANG[7]、谢小保等[9]分别对中国酱油、WEI等[19]对中国酱油、TANASUPAWAT等[15]对泰国酱油中的耐盐细菌做了系统性的分离鉴定工作。另外国内的研究机构江南大学近些年也不断有相应的研究成果 报道。

在酱油中被广泛报道的细菌有乳酸菌、芽孢杆菌属、葡萄球菌属等。乳酸菌包括魏斯氏菌属（Weissella）等[21]，它是一类能利用各类糖类化合物作为产物生成底物乳酸的细菌的总称，酱油发酵中的乳酸菌通常还具有耐受高盐（至少8%，见表1）这一普通乳酸菌不具备的性质，通过在发酵环境中产生有机酸及分泌肽类物质，如抑菌肽，将酱醪体系转变为偏酸的环境，能在一定程度上抑制杂菌的生长，有利于一些酵母的生长及代谢。

赵国忠等[13]将从老厂酱醪中分离到的一株耐盐植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）添加到酱油发酵中，气相色谱-质谱检测结果显示添加了这株植物乳杆菌后，发酵酱油中酮类、酚类和醇类等物质增加显著。另外，该酱油总酸、氨基态氮、可溶性无盐固形物这3项指标都有显著提高，其中包括乳酸含量，而其他有机酸含量略有下降。同时结果表明该植物乳杆菌可促进生成更多的单糖、氨基酸、乳酸等小分子化合物，从而增强酱油的风味。此研究为今后酱油的品质改良打下良好的理论基础。

传统发酵食品中魏斯氏菌广泛存在，具有较高的应用价值。胡传旺[6]通过对高盐稀态酱油中耐盐细菌的代谢产物进行分析时发现魏斯氏菌在高盐（18%）培养条件下均能水解原料，产生较多的鲜味氨基酸。李巧玉等[12]发现，12株从酱油中得到的魏斯氏菌在高盐培养条件下，有1株可降解利用多种生物胺，有3株菌反而会产生生物胺，不过大多数菌株不产生物胺。另外结果显示这12株魏斯氏菌在高盐体系中均能生成多种有机酸和多种胞外多糖等功能性物质，从而改善酱油的口感和营养。

杨怡敏[22]发现乳酸足球菌（Pediococcus acidilactici） BBE 1120能够积累瓜氨酸，而且正是因为高盐环境、碳源种类及浓度等因素引起该微生物积累瓜氨酸，其中高盐是最主要因素。通过比较不同来源的乳酸足球菌菌株，发现这些乳酸足球菌在18%盐浓度条件下，利用底物精氨酸生成产物瓜氨酸的转化率是有差异的，对高盐耐受性强的菌株的转化率相对较低。作者分别对不同菌株产生物胺的能力进行了定性和定量分析，结果表明该菌不产测定的8种生物胺。此外通过分析发现，乳酸足球菌能够在高盐环境下降解8种生物胺。

胡传旺[6]发现嗜盐四联球菌（T. halophilus）不仅会产生大量的有机酸，而且还会产生较多的挥发性物质。杨希飞[23]发现嗜盐四联球菌可代谢瓜氨酸（它是由精氨酸脱亚氨酶途径产生）和氨基甲酸乙酯。接入嗜盐四联球菌对于酱油风味的提升有意义，而且酱油中的各类风味物质（酸、醛、酮、酯、酚和吡嗪类等物质）的含量也分别比对照提高不少。

另外葡萄球菌作为风味细菌在发酵肉制品中应用较多，其本身具有很强的耐高盐能力，容易驯化。胡传旺等[24]从酱油中分离得到一株葡萄球菌JY09，其产生的挥发性物质较多。

芽孢杆菌的蛋白酶及淀粉酶一般酶活较高，有利于酱油中蛋白质及淀粉的分解。PALANIYANDI等[25]从韩国酱油（Ganjang）中分离到了一株索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis），发现其产胞外多糖的能力突出，可抑制一些病原微生物的生长，可以作为益生菌，但该研究未对其在酱油发酵中的功能进行考察。JIANG等[8]从天然晒露法酿制酱油中分离鉴定了一株耐盐枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），发现其在酱油发酵过程中具有改善酱油香气的作用，香气成分中的酚、酮、酯均有不同程度的增加。

酱油风味细菌的研究起步较晚，在生产中的应用程度较浅。此外，尚有许多风味细菌未被应用或发现，这需要此领域内的学者们进行更加深入的研究。

2.2 抗逆酵母

Candida（C. parapsilosis、C. etchellsii、C. guilliermondii var. membranaefaciens、C. famata、C. pulcherrima、C. lusitaniae、C. orthopsilosis）、Debaromyces（D. hansenii var. fabryi）、Sterigmatomyces、Meyerozyma（M. guilliermondii）、Torulopsis、Saccharomyces、Trichosporon、Cryptococcus（C. albidus）、Microbotryum（M. violaceum）、Pichia（P. guilliermondii、P.sorbitophila）、Rhodotorula（R. mucilaginosa、R. glutinis）、Tetrapisispora（T. blattae）、Torulaspora（T.delbrueckii）、Wickerhamomyces（Wickerhamomyces. anomalus）等酵母得到了分离鉴定。其中，冯杰[14]将分离到的C. etchellsii添加到酱油的发酵生产中，发现它对于酱油的质量和风味具有显著的促进作用。结果表明，氨基态氮和可溶性无盐固形物含量分别达到（9.15±0.12）g·L-1和（269.60±3.15）g·L-1，相较于对照分别增加了23.1%和17.6%。样品中最高的游离氨基酸含量和39种挥发性风味化合物总量分别达到（58.21±1.77）g·L-1和（17.81±0.45）g·L-1，相较于对照分别提高了1.76%和178.7%。酱油中的典型风味物质，如4-乙基愈创木酚和HEMF等物质均有所增加，更好地促进了酱油风味质量的改善和提高。

YANG等[7]和ARYUMAN等[16]两个不同的团队各自从酱油中分离到了季也蒙念珠菌（Meyerozyma guilliermondii）这类耐盐酵母。YANG等还从酱油中检测出10种特征香气成分，包含醛、酮、醇、酸和酯等不同的化合物，这10种化合物中主要的、能够为酱油的特征风味带来积极影响的挥发性物质分别为2-苯基乙醇和3-甲基-1-丁醇。而ARYUMAN等分离到的季也蒙念珠菌还能产生谷氨酰胺酶，而且酶活随着盐浓度的增大而增大，在18%高盐浓度下达到最大，可见高盐环境下该酵母可以使底物L-谷氨酰胺生成产物L-谷氨酸的水解反应加速，对酱油产品鲜味的提升具有重要作用。因此两个团队均认为该类酵母具有进一步添加到酱油生产中去提升酱油品质的 价值。

3 结语

长期以来人们对传统食品发酵行业的基础研究不够重视，对酱油生产中的抗逆微生物分离、鉴定、选育方面的研究相对滞后，尤其是对其中的细菌的研究相对较少，这不利于研究酱油发酵体系中的微生物群落组成以及各自的角色功能。但随着生活水平的不断提高，人们对高品质酱油的需求也越来越大。这也为酱油酿造行业带来了新的发展契机。

消费者对酱油品质的追求促进了高品质酱油酿造工艺的发展，酱油抗逆微生物的研究及其应用成为推动工艺发展的重要途径，也将成为研究的热点之一。各种耐盐细菌与主发酵菌种在长期发酵中相互作用，代谢产生的各种物质相互反应，构成了酱油复杂的风味物质体系，从而形成了酱油特有的风味。随着高通量测序、基因组学、转录组学、蛋白质组学及代谢组学等现代生物技术的应用，深入研究酱油抗逆微生物、扩大其应用优势、发掘其在酿造中的应用潜力、实现多菌种混合发酵及优化酱油风味，将为生产安全健康、鲜咸适口、酱香醇厚的优质酱油提供有力保障。