全自动固相萃取-高效液相色谱法测定 酱卤肉制品中胭脂红的优化

◎ 苏骏敏，沈昌莹，张树权

（东莞市食品药品检验所，广东 东莞 523808）

胭脂红，又称为酸性红18、丽春红4R，属于合成着色剂，是一种被广泛应用于食品工业中的单偶氮类人工合成色素[1]。人工合成色素与天然色素相比，具有着色能力强、稳定性好、成本低廉等优势[2]。因此酱卤肉制品在生产过程中有时会加入胭脂红，以改善食品的色泽外观，提高人们的食欲。但人工合成色素具有慢性毒性，在人体内蓄积分解后，有可能会转化成致癌物质，且具有致畸性，长期过量使用危害人体健康[3-8]。同时，不法分子可能通过使用胭脂红掩盖变质肉等不良原料的外观[9-10]。依据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[11]的规定，酱卤肉制品中禁止使用胭脂红，但仍存在不少不法商贩在酱卤肉制品生产过程中超范围使用胭脂红。目前，测定食品中胭脂红的国标检测方法有 GB/T 9695.6—2008[12]和GB 5009.35—2016[13]，该检测方法前处理操作步骤烦琐，均采用聚酰胺吸附法，实验过程中有大量目标物损失，且对于油脂含量较高的样品在检测中易出现提取率低、净化效果不佳、回收率较低等问题，不适用于大批量样品的检测。

本研究在现行国标检测方法基础上，对除脂、提取和净化步骤进行改进，采用固相萃取法替代国标方法中的聚酰胺粉末吸附法，通过全自动固相萃取仪，自动完成固相萃取净化全过程，以期为酱卤肉制品中胭脂红的测定提供一种快捷、灵敏度高的检测 方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪（配备1240-元素光电二极管阵列检测器，美国安捷伦科技有限公司）；Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪（厦门睿科仪器有限公司）；3K 15高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；HS 501数显型振荡摇床（德国IKA公司）；Evatros氮吹浓缩仪（Goojung公司）；METTLER TOLEDO SevenExcellence型数字式精密酸度计（美国梅特勒公司）。

甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；无水乙醇、一水合柠檬酸（分析纯，广州化学试剂厂）；氨水（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；乙酸铵（色谱纯，山东西亚化学股份有限公司）；甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；Cleanert PWAX固相萃取柱（6 mL，500 mg）、Cleanert PA聚酰胺固相萃取柱（6 mL，1 g）（北京艾杰尔科技公司）；Oasis WAX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、Oasis HLB（200 mg，6 mL）（美国Waters公司）；Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid（美国安捷伦科技有限公司）；0.45 μm水系滤膜（深圳逗点生物技术有限公司）；实验室用水为Milli-Q超纯水；胭脂红标准品（批号22001，浓度0.500 mg·mL-1，中国计量科学研究院）。

样品来自广东省内生产企业生产环节抽样。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

甲醇-甲酸溶液（3+2，体积比）：量取甲醇30 mL， 甲酸20 mL，混匀；15%氨水甲醇溶液：取15 mL氨水，用甲醇定容至100 mL；20%乙醇-氨溶液：量取20 mL氨水、70 mL无水乙醇、10 mL水，混匀；柠檬酸溶液：称取20 g 柠檬酸，加水定容至100 mL；水（pH=6.0）：取100 mL水，用柠檬酸溶液调节pH至6.0；水（pH=4.0）：取100 mL水，用柠檬酸溶液调节pH至4.0。

1.2.2 样品前处理

称取5 g（精确至0.001 g）粉碎均匀的酱卤肉制品于50 mL离心管中，加入20%乙醇-氨溶液20 mL，旋紧盖子，涡旋1 min，置于振荡摇床上振荡提取20 min 后，于-18 ℃冷冻30 min，8 000 r·min-1、4 ℃离心5 min， 上清液转移至50 mL容量瓶中，再分别用15 mL、10 mL提取液重复提取2次，合并提取液，用乙醇-氨溶液定容至刻度。精密移取上清液10 mL，70 ℃氮吹浓缩至约2 mL，混匀后待净化。

全自动固相萃取：依次用6 mL甲醇、6 mL水（pH=6.0）活化后，上样，再用6 mL水（pH=4.0）、6 mL甲醇-甲酸（3+2），6 mL水（pH=6.0）淋洗，6 mL 15%氨水甲醇溶液洗脱。收集洗脱液，70 ℃氮吹至近干，残渣用1 mL水溶解，经0.45 μm水系滤膜过滤后进高效液相色谱仪检测分析。

1.2.3 仪器条件

（1）全自动固相萃取仪净化程序详见表1。

表1 全自动固相萃取仪净化程序表

（2）液相色谱仪条件。色谱柱：Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相：A甲醇；B 0.02 mol·L-1乙酸铵溶液；梯度洗脱程序见表2；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：30 ℃；检测波长 508 nm。

表2 流动相洗脱梯度表

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

2.1.1 除脂条件的优化

酱卤肉制品中含有大量的油脂，其对胭脂红的提取存在较大影响，且易在净化时堵塞固相萃取柱，因此在前处理提取过程中需去除脂肪。根据文献[14]，QuEChERS EMR-Lipid可用于去除样品基质中脂质的干扰，本文采用冷冻去脂（-18 ℃）、QuEChERS方法、石油醚除脂方法进行比较分析，考察3种除脂方法对酱卤肉制品中胭脂红提取的影响，提取率结果见 表3。

表3 不同除脂方法下胭脂红的提取率表（n=3）

根据表3结果可知，经过冷冻去脂的酱卤肉制品的胭脂红提取率最高，QuEChERS方法的提取率最低。同时，分别比较了-18 ℃、4 ℃、常温下离心对样品中胭脂红提取率的影响，发现在4 ℃离心的提取率最高。因此，选用冷冻去脂并在4 ℃离心作为酱卤肉制品的去脂方法。

2.1.2 提取液氨水浓度的选择

胭脂红极性较强，易溶于水，难溶于乙醇。用水作为提取液，提取效果不理想，难以提取出与蛋白质结合的胭脂红，且提取液中杂质较多。因此，分别用10%、20%、30%、40%和50%氨水溶液作为提取液，考察氨水浓度对酱卤肉制品中胭脂红提取效率的影响，结果见图1。

由图1可知，当氨水浓度为20%时，胭脂红的提取效率最高。当氨水浓度在20%～50%时，随着氨水浓度的升高，提取液愈发浑浊，这是由于氨水浓度过高导致样品中的脂肪游离进提取液。氨水浓度过高不利于后续冷冻除脂，导致提取液中干扰增多，提取效率下降。因此最终选择20%氨水溶液，即为无水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）作为提取液。

图1 不同浓度氨水下胭脂红的平均提取效率图（n=3）

2.1.3 固相萃取柱净化条件的优化

本研究参考了国标和相关文献[12-17]，研究考察胭脂红标准溶液用Cleanert PWAX（500 mg，6 mL）、Cleanert PA（1 g，6 mL）、Oasis WAX（150 mg，6 mL）和Oasis HLB（200 mg，6 mL）固相萃取柱在不同淋洗和洗脱条件下的回收率，结果见表4。

表4 不同固相萃取柱在不同淋洗、洗脱条件下的回收率表

由表4可看出，Cleanert PWAX固相萃取柱回收率在0%～70%，Oasis HLB固相萃取柱回收率在19%～30%，且PWAX柱使用较低浓度的氨水甲醇溶液不能将胭脂红从柱中洗脱出来，HLB柱对胭脂红的吸附效果不佳，很难保留。Oasis WAX柱在使用水和甲醇淋洗时回收率较好，能达到70%以上，随着氨水甲醇洗脱液浓度的增加，回收率逐渐上升。Cleanert PA萃取柱在使用甲醇-甲酸（3∶2）作为淋洗液，15%氨水甲醇洗脱时，效果较好，回收率可达到90%以上。

对比胭脂红样品加标提取液过柱净化效果情况，结果如图2所示。结果表明，经Cleanert PA柱净化后胭脂红的回收率最高，Oasis HLB柱回收率最低。综合考虑到胭脂红的回收率，以及为降低废液污染和节约成本，最终选择水（pH=4.0）、甲醇-甲酸（3∶2）、甲醇作为淋洗液，15%氨水甲醇作为洗脱液，Cleanert PA作为净化用固相萃取柱。

图2 不同固相萃取柱对胭脂红回收率的影响图（n=3）

2.1.4 氮吹浓缩温度的优化

将洗脱液收集于10 mL试管中，分别考察在55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃下进行氮吹的胭脂红的回收率。结果表明，氮吹温度对胭脂红的回收率影响不明显，考虑到在55 ℃～65 ℃下氮吹耗时较长，因此确定氮吹温度为70 ℃。

2.1.5 针式过滤器的选择

洗脱液经氮吹至近干后，加水定容至1 mL，过 0.45 μm滤膜后上机检测。考察对比北京振翔科技有限公司的亲水PTFE滤头、津腾的PTFE滤头和深圳逗点生物技术有限公司的PES滤头、上海安谱实验科技股份有限公司的Nylon滤头。上机结果显示，经PES滤头过滤的待测液中胭脂红含量较高，原因可能是Nylon和PES膜对胭脂红有所吸附[17-18]。故选用深圳逗点生物技术有限公司的PES滤头用于洗脱液的过滤。

2.2 标准曲线线性范围及方法检出限

准确吸取适量胭脂红标准物质适量，用水稀释成浓度为50.0 µg·mL-1的贮备液，再用水将贮备液依次稀释成浓度为0.01 µg·mL-1、0.05 µg·mL-1、0.10 µg·mL-1、0.20 µg·mL-1、0.50 µg·mL-1、1.00 µg·mL-1、2.00 µg·mL-1、5.00 µg·mL-1、10.00 µg·mL-1和20.00 µg·mL-1的标准工作溶液，进样量为10 µL，以胭脂红质量浓度（X，µg·mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，建立标准校准曲线。胭脂红质量浓度在0.01～50.00 µg·mL-1线性良好，相关系数≥0.999，斜率为0.827 3。按照本试验前处理方法对加标样品进行处理，以色谱峰3倍信噪比 （S/N=3）求得方法检出限（Limits of Detection，LOD），本方法胭脂红的方法检出限为0.02 mg·kg-1，低于国标方法GB/T 9695.6—2008，满足试验要求。

2.3 加标回收率和精密度

平行称取18份酱卤肉空白基质样品，分别在 0.1 mg·kg-1、5.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-13个水平下进行加标回收试验，每个浓度加标样品重复测定6次，加标回收率结果见表5。由表5可知，胭脂红在3个添加水平的回收率为85.2%～94.7%，满足GB/T 27404—2008[19]附录F.1中要求被测组分含量在0.1～1.0 mg·kg-1以及1～100 mg·kg-1，回收率分别在80%～110%、90%～110%的要求。与国标方法GB/T 9695.6—2008回收率60%～80%相比较，本方法回收率显著提升，且精密度良好，能满足检测的要求。

表5 加标回收率和精密度表（n=6）

3 结论与讨论

本研究采用无水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）作为提取液，通过冷冻除脂、低温离心，使用聚酰胺固相萃取柱，采用固相萃取法替代国标中的聚酰胺吸附法[20]，并且全过程无需对提取液调节pH值，氮吹后定容即可上机，适用于富含油脂的酱卤肉制品中的胭脂红的测定。同时，采用全自动固相萃取仪进行净化，无需人工干预，自动完成固相萃取柱的活化、上样、淋洗、洗脱和收集等全过程。采用本方法进行测定，回收率与相关文献方法比较有较大的提升，方法检出限低于国家标准方法GB/T 9695.6—2008。同时，本方法前处理方便快捷，节省了提取净化用试剂的消耗，降低污染，能满足大批量酱卤肉制品中胭脂红的日常检测。