蛴螬肽提取物对铅致小鼠肾中毒的解毒保护作用机制研究

李子萱,吴琼,张华,温海京,张鑫玉,张永红,沈红,崔德凤

(北京农学院动物科学技术学院,兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京 102206)

铅元素是环境中广泛分布的一种有毒性重金属,各行业中都有所应用,在当今世界中铅已经成为了不可或缺的金属,但铅金属所导致的环境污染,使铅中毒患者数量增多[1]。 铅能在机体体内长期累积致全身多系统损害,研究显示,儿童比成人对铅元素的吸收要高,滞留在体内的铅元素对儿童的生长发育造成一定影响[2]。 目前,常用的驱铅药物为依地酸钙钠,其排铅效果虽好,但会引起机体出现多种副作用,如头晕、恶心、畏寒、发热、食欲不振等症状[3]。 因此,开发低毒天然药物成为生物医学研究热点。 研究发现,治疗儿童高铅血症时服用杞枣口服液、黄芪健脾汤、丹参注射液等[4-5]多种中药对铅中毒进行治疗后,能减轻铅中毒所产生的情绪不稳定、腹痛、食欲差等不良反应且降铅疗效果好[6]。 在中医学记载中,蛴螬是金龟子等同属近缘昆虫的幼体,其具有破血、散瘀、明目、通乳的作用[7],可治疗痈疽、痔漏、丹毒、跌打损伤等症[8]。 《神农本草经》中有记载“目中淫肤、青翳白膜”为蛴螬主治功能之一,现代医学已证实以蛴螬为主成分的滴眼液对白内障具有良好的治疗效果[9]。 近年研究表明,蛴螬肽提取物呈现多种药理作用,如抗氧化、抗肿瘤、抗菌、解毒保肝等作用[10]。 Oh 等[11]发现蛴螬可使脂肪肝小鼠血浆中丙氨酸转氨酶和ALP 的活性降低,HE 染色切片观察到肝细胞病变有明显的改善,结果减轻了小鼠肝损伤。 当机体受到不良刺激时,核转录因子E2 相关因子2(Nrf2)与核内抗氧化反应元件(ARE)结合激活Nrf2-ARE 信号通路,使下游II相解毒酶、抗氧化酶基因表达增加[12],如醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素加氧酶-1(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)等,促进了细胞内的氧化还原反应、维持细胞内平衡,并且共同参与机体应激的抗氧化和解毒保护作用[13-14]。 经研究发现,由于肾功能下降,肾小管损伤标志物的表达量增加,氧化应激等因素的影响,与正常组小鼠相比,Nrf2 缺陷型小鼠的急性肾损伤更加严重,提示Nrf2 对肾损伤有一定保护作用[15]。 地鳖肽与蛴螬肽提取物联合应用时能清除自由基,抑制脂质过氧化反应[16]。但蛴螬肽提取物能否通过Nrf2-ARE 信号通路表现解毒保护作用仍未知。 因此,本研究拟通过建立醋酸铅致小鼠肾中毒模型,探讨蛴螬肽提取物对肾中毒小鼠的解毒保护作用及其机制,为未来研发蛴螬肽提取物作为高效解毒保护剂,及其在养殖业中应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

72 只8 周龄清洁级雄性KM 小鼠,体重21 ～26 g,购于中国军事医学科学院实验动物中心【SCXK(军)2019-0002】,饲养于北京农学院实验动物房【SYXK(京)2021-0001】,温度22 ～ 24℃,湿度恒定,昼夜光照各半,实验期间小鼠自由采食、饮水。 本实验所有操作均符合北京农学院兽医药理学实验室伦理要求(BUA2021042)。

1.1.2 主要试剂与仪器

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肌酐(creatinine,Cr)、和丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒均购自南京建成生物有限公司(货号分别为:A005-1-2、C013-1-1、A001-3-2、C011-2-1、A003-1-2);全蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(货号:BC3710);BCA 蛋白检测试剂盒、ECL 化学发光试剂盒购自碧云天生物技术公司(货号分别为: P0012、 P0018S); 兔 源 NQO1、 HO-1、 Nrf2、GAPDH 抗体和HRP 标记山羊抗兔IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司(货号分别为:bs-2184R、bs-273397R、 bs-1074R、 bs-0755R、 bs-40295G-HRP);HiFi-MMLV cDNA Kit 购自康为试剂生物科技有限公司(货号:CW0744M);醋酸铅(Pb)、二巯基丁二酸(DMSA)购自北京爱普锐晟科技有限公司(货号分别为:316512-25G、R050651-25g);蛴螬多肽(grub polypeptide)提取物由北京农学院兽医药理实验室【SYXK(京)2021-0001】制备;所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

UV-3 紫外可见分光光度(上海美普达有限公司);低温高速离心机(Eppendorf 公司);超低温冰箱(SANYOO,日本);S1000 Theral Cycler 梯度PCR仪(Bio-Rad,美国);CFX Connect 荧光定量PCR 检测系统(Bio-Rad,美国)。

1.2 方法

1.2.1 分组与小鼠肾中毒模型建立

72 只8 周龄清洁级雄性KM 小鼠,随机分为对照组、模型组、阳性药组、不同剂量蛴螬肽组(80、160、320 mg/kg)。 每组12 只小鼠,实验期间自由采食、饮水。 为构建铅中毒小鼠模型,正常组小鼠腹腔注射20 mg/kg 生理盐水,其余各组小鼠均隔天腹腔注射20 mg/kg 醋酸铅1 次,连续15 d,此后正常组、模型组小鼠灌服生理盐水,阳性药组小鼠灌服70 mg/kg DMSA 混悬液,蛴螬肽组灌服不同剂量蛴螬肽提取物(80、160、320 mg/kg),每天1 次连续15 d。

1.2.2 血清学指标检测

实验期间小鼠每周称重,小鼠末次给药24 h后,用4%异氟烷麻醉小鼠后眼眶采血,制备血清采用试剂盒检测血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醇(MDA);小鼠颈椎脱臼处死后,取出肾进行肉眼观察并称重。 取1 g 肾组织与9 mL 生理盐水于研磨瓶中,研磨制备10%肾组织匀浆液,部分肾组织低温冻存备用;处理数据并计算肾重量指数 =(肾重量/小鼠体重)× 100%。

1.2.3 肾组织病理观察

取小鼠部分肾置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定,制作肾组织切片,HE 染色后光学显微镜下观察组织结构并拍照。

1.2.4 RT-PCR 检测小鼠肾组织中II 相解毒酶、抗氧化酶及关键分子基因表达水平

采用TRIzol 提取肾组织中RNA,测浓度后反转录成cDNA,以GAPDH 为内参用RT-PCR 仪扩增,引物序列见表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence

1.2.5 Western Blot 检测小鼠肾组织中Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶及关键分子蛋白表达水平

取肾组织匀浆,加入蛋白裂解液并离心(-4℃,12000 r/min,30 min)。 BCA 法测蛋白浓度,制备10%下层胶,进行SDS-PAGE 使蛋白分离,转膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h。 用TBST 缓冲液清洗后加入NQO1、HO-1、Nrf2 及GADPH(1 ∶1000)抗体,4℃冰箱过夜孵育后用TBST 缓冲液清洗,加入HRP 标记山羊抗兔IgG(1 ∶1000)孵育2 h。 TBST 缓冲液清洗后加入ECL 显色液,用Bio-Rad 系统显影并分析。

1.3 统计学分析

所有数据经SPSS 19.0 和GraphPad Prism 9 软件统计分析,结果用平均值 ± 标准差(±s)表示,两组间比较运用t检验方法,P＜ 0.05 为差异具有显著性,P＜ 0.01 为差异极具显著性。

2 结果

2.1 蛴螬肽提取物对铅致肾中毒小鼠精神状态和体重的影响

经肉眼观察,实验期间对照组小鼠精神状态良好,食欲正常;模型组小鼠表现为烦躁不安、被毛粗乱,而后表现为精神萎靡、嗜睡、采食量下降;阳性药组和蛴螬肽组小鼠表现较为安静、嗜睡、未见明显异常。 第1 周时各组体重无明显差异;第2周开始模型组小鼠体重显著低于对照组(P＜0.05),阳性药组和蛴螬肽组小鼠体重较对照组无显著性差异;第3、4、5 周时模型组小鼠体重极显著低于对照组(P＜ 0.01),阳性药组、蛴螬肽组与模型组相比小鼠体重呈现极显著性增长(P＜0.01,图1)。

2.2 蛴螬肽提取物对铅致肾中毒小鼠肾指数的影响

模型组小鼠肾指数极显著高于对照组(P＜0. 01);阳性药组小鼠肾指数较对照组无显著性差异;经蛴螬肽提取物给药后,低剂量蛴螬肽组小鼠肾指数显著低于模型组(P＜ 0. 05);中、高剂量组小鼠肾指数极显著低于模型组(P＜0. 01,图2)。

2.3 蛴螬肽提取物对铅致肾中毒小鼠肾组织结构的影响

肉眼观察小鼠肾形态,对照组小鼠肾颜色呈淡红色且有光泽,形态正常,无肉眼可见病理变化;模型组左肾出现白色斑点,右肾出现坏死点并与其他周围组织严重粘连(图3);阳性药组和不同剂量蛴螬肽组肾颜色及形态有显著改善。 肾组织切片HE染色后显微镜下观察,对照组小鼠肾小球形态、大小正常,边界清晰,无明显结构损伤;模型组小鼠肾小球萎缩,近端小管轮廓模糊、形态不规则,肾小管内有渗出物;阳性药组和蛴螬肽组小鼠肾小球萎缩程度、官腔形态有所改善(图4)。

2.4 蛴螬肽提取物对铅致肾中毒小鼠肾功能的影响

为进一步了解小鼠肾功能,采用试剂盒检测肾血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)指标变化。 与对照组相比,模型组小鼠肾BUN 和Cr 水平极显著升高(P＜ 0.01);阳性药组无显著性差异。 与模型组相比,阳性药组小鼠肾BUN 和Cr 水平极显著下降(P＜ 0.01);低剂量组与模型组无显著性差异;中剂量组小鼠肾BUN 与模型组无显著性差异,中剂量组小鼠肾Cr 较模型组显著降低(P＜ 0.05);高剂量组小鼠肾BUN、Cr 水平极显著下降(P＜0.01,图5)。

2.5 蛴螬肽提取物对铅致肾中毒小鼠肾组织中抗氧化酶及过氧化反应的影响

小鼠肾组织中抗氧化酶水平及过氧物含量经试剂盒检测后,与对照组相比,模型组GSH-Px、SOD水平极显著低于对照组(P＜ 0.01);阳性药组和蛴螬肽组中GSH-Px、SOD 水平均呈现上升趋势,随着蛴螬肽提取物剂量的增加,肾组织中的GSHPx、SOD 水平逐渐升高,其中高剂量组肾组织中的GSH-Px、SOD 水平增加最显著(P＜ 0.05)。 模型组小鼠肾组织中丙二醛(MDA)含量与对照组相比极显著增加(P＜ 0.01);阳性药组较对照组无显著性差异;蛴螬肽组MDA 含量均有不同程度的降低,并随着蛴螬肽提取物剂量的增加,小鼠肾组织中MDA 含量逐渐降低,其中高剂量组与模型组相比极显著下降(P＜ 0.01),与对照组相比无显著性差异(图6)。

2.6 蛴螬肽提取物对小鼠肾组织中II 相解毒酶、抗氧化酶及关键分子基因表达的影响

通过RT-PCR 技术分析Nrf2-ARE 信号通路相关基因和关键分子基因表达水平,与对照组相比,模型组小鼠肾组织中NQO1 和HO-1 的mRNA 表达量极显著降低(P＜ 0.01);阳性药组显著高于模型组(P＜ 0.05);而蛴螬肽组随着蛴螬肽剂量增加其mRNA 表达量增加。 与对照组相比,模型组小鼠肾组织中Nrf2 分子mRNA 表达量极显著降低(P＜0.01);与模型组比,经蛴螬肽提取物处理后低、中剂量组Nrf2 的mRNA 表达量无显著性差异,而高剂量组mRNA 表达显著增加(P＜ 0.05,图7)。

2.7 蛴螬肽提取物对小鼠肾组织中II 相解毒酶、抗氧化酶及关键分子蛋白表达的影响

经Western Blot 法检测NQO1、HO-1 和Nrf2 蛋白表达量,与对照组相比,模型组NQO1、HO-1 蛋白表达极显著降低(P＜ 0.01),Nrf2 蛋白表达显著降低(P＜ 0.05);阳性药组无显著性差异。 经蛴螬肽提取物给药后,低、中、高剂量的蛴螬肽组与模型组相比,NQO1、HO-1 和Nrf2 蛋白表达均有不同程度的上调。 其中,低、中剂量组NQO1 蛋白表达较模型组显著增加(P＜ 0.05);高剂量组则呈极显著增加(P＜ 0.01)。 低、中剂量组HO-1 蛋白表达较模型组无显著性差异;高剂量组呈极显著增加(P＜0.01)。 低、中剂量组Nrf2 蛋白表达较模型组无显著性差异;高剂量组呈显著增加(P＜ 0.05,图8)。

3 讨论

当含铅物质进入机体后对各个组织器官均可产生一定影响,其中肾对含铅物质极为敏感。 肾中的铅不断积累后会导致肾的形态和功能出现变化[17]。 肾形态出现肾小球上皮细胞萎缩,肾小管形态不规则,毛细血管扩张充血;肾功能下降,肾小球滤过功能降低,肾小管损伤等。 以上原因会导致BUN 和Cr 不能随尿液排出而增高,并在体内蓄积使肾受到损伤[18]。 临床上以BUN、Cr 作为肾检测指标,二者水平变化可反应肾功能的变化。 本实验研究发现,铅中毒小鼠体重降低,肾颜色及形态发生改变,肾组织中BUN 和Cr 水平升高。 可提示醋酸铅对小鼠肾造成了损伤,小鼠肾中毒模型建立成功。 而经不同剂量蛴螬肽处理的小鼠体重、肾形态有所改善,BUN、Cr 的水平降低,由此可提示蛴螬肽提取物可缓解铅中毒所致的小鼠肾损伤。

经研究显示,机体内的氧化系统和抗氧化两系统在正常情况下处于平衡状态,但当机体受到某些因素产生的氧化刺激时,会产生对机体造成损害的自由基[19],体内GSH-Px 是抗氧化系统中重要的酶类,可保护机体免受自由基的伤害[20]。 SOD 是抗氧化系统中首要参与反应的物质[21],可与超氧阴离子相作用从而清除自由基[22]。 MDA 是机体受到氧化刺激后所产生的过氧化产物,其含量可体现出体内自由基水平及受损情况[23]。 本研究结果中模型组肾抗氧化酶活性降低且过氧化物水平高,而阳性药组和蛴螬肽组小鼠肾组织中GSH-Px 和SOD 水平显著升高,MDA 水平降低,结果表明蛴螬肽提取物可增强抗氧化酶防御系统,从而去除活性氧自由基,降低脂质过氧化反应,并缓解铅中毒引起的肾组织损伤,提示蛴螬肽提取物对肾损伤有保护作用。

Nrf2-ARE 信号通路与机体内源性抗氧化应激系统和解毒调节传导系统有关,在氧化应激反应应答中起关键作用[24]。 HO-1 为抗氧化酶对细胞有一定保护作用,当机体受到损伤时可清除自由基并对机体产生抗氧化效应[25]。 NQO1 可与部分有毒物质产生反应并将其清除,抑制脂质过氧化反应从而稳定细胞[26]。 Nrf2 是机体中重要的物质分子,广泛存在于各细胞中,若机体细胞Nrf2 缺失可能导致肺炎、肝病、肾病、神经性病变等[27]。 研究显示,小鼠在白茶提取物的作用下,使NQO1、HO-1 和Nrf2 表达量增加,通过激活Nrf2-ARE 信号通路从而保护了肾免受阿霉素引起的蛋白质和脂质氧化损伤[28]。姜黄素和百里香醌联合应用时,可缓解大鼠肾组织损伤,增强肾功能,上调BUN、Cr 水平及Nrf2、HO-1蛋白表达量,从而减轻顺铂对肾产生的毒副作用[29]。 木犀草素可激活Nrf2-ARE 信号通路,抑制氧化应激,缓解了醋酸铅致大鼠肾毒性[30]。 本研究结果显示,与模型组相比,经蛴螬肽提取物处理后,小鼠肾组织中NQO1、HO-1、Nrf2 的mRNA 和蛋白水平显著增加。 该结果表明,蛴螬肽提取对肾中毒小鼠的解毒保护作用,可能通过激活Nrf2-ARE 信号通路,减少铅中毒对机体的损伤。

综上所述,醋酸铅致肾中毒小鼠,在蛴螬肽提取物的作用下,可增强小鼠肾组织中抗氧化酶活力,降低过氧化反应,上调II 相解毒酶、抗氧化酶及关键分子Nrf2 基因和蛋白的表达,达到改善肾组织结构和提高肾功能等解毒保护作用,其机制可能与激活机体内源性Nrf2-ARE 信号通路有关。

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