网络药理学联合GEO芯片及分子对接探讨通窍活血汤治疗阿尔茨海默病的机制

王 伟 宫秀群

阿尔茨海默病（alzheimer's disease,AD）是一种隐匿起病、进行性发展的神经退行性疾病。AD的主要临床特征为认知障碍、精神行为异常和社会生活功能减退。据WHO统计，目前全球约有5 000万人患有痴呆，其中AD是最常见的类型。《中国阿尔茨海默病报告2022》[1]指出，我国60岁以上痴呆患者有1 507万，其中AD患者有983万。AD患者的生活能力下降，需要长期的护理和医疗服务，给家庭和社会带来沉重的经济和护理负担。一项全国性研究显示，2015年中国AD患者的年治疗费用为1 677.4亿美元，且持续上升，预计到2050中国AD患者的年治疗费用将达1.8万亿美元。

AD的发病机制复杂，涉及多个病理生理过程，如β淀粉样蛋白沉积、tau蛋白磷酸化、神经炎症、神经元损伤和凋亡、突触可塑性受损、乙酰胆碱等神经递质不足等[2]。现有的治疗药物如胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂等只能改善和缓解临床症状，但不能逆转病情的发展且存在副作用[2]。长期的临床实践表明，中药复方因副作用小，且具有多成分多作用靶点的特点，成为近年来AD药物研究的热点[3]。

通窍活血汤（Tongqiao Huoxue decoction,TQHXD）是清代名医王清任创立的中医经典方剂，由桃仁、红花、川芎、赤芍、大枣、葱、生姜和麝香8味中药构成，具有通窍醒神、活血化瘀之功效。多项临床研究表明，TQHXD能够改善痴呆患者的认知功能，提高日常生活能力[4-5]。但TQHXD治疗AD的机制仍不明确，本文以TQHXD中活性成分为研究对象，应用网络药理学结合GEO芯片及分子对接方法，挖掘TQHXD的主要活性成分和靶点，建立中药活性成分-靶点-疾病之间的关系，探究TQHXD治疗AD的分子基础和作用机制，为TQHXD的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 TQHXD药物成分及靶点获取

通过检索中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）获得TQHXD中桃仁、红花、川芎、赤芍、大枣、葱、生姜7味中药的所有化合物成分，TCMSP数据库未收录麝香，故通过检索TCMID（http://47.100.169.139/ tcmid）数据库获得麝香的药物成分。根据吸收、分布、代谢、排泄（absorption,distribution,metabolism,and excretion,ADME）规则，以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%，药物类药性（drug-likeness,DL）≥0.18为筛选条件，筛选TQHXD有效成分[6]。中药的活性成分通过调节靶点来发挥相关的生物功能。基于配体预测法，通过TCMSP数据库获得TQHXD各个有效成分的作用靶点。

1.2 AD差异基因获取

GEO数据库是美国国家生物技术信息中心（NCBI）的一个子数据库[7]，收集了世界各国研究机构提交的人、大鼠、小鼠等基因表达、测序及甲基化数据。通过对芯片进行差异分析，可以筛选出在疾病等特定环境下差异表达的基因网络。通过 GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库，以Alzheimer’s disease为检索词，物种限定为Homo sapiens获取GSE33000数据集文件，包括非痴呆对照组157例，AD组310例，样本均来自贡献者死后的前额叶皮层（BA9）。应用R语言limma包对表达矩阵进行差异分析，以|log2FC|＞0.2，P＜0.05为条件，筛选出AD组和非痴呆对照组的差异基因，采用R语言ggplot2包绘制差异基因火山图。

1.3 TQHXD药物成分-靶点-差异基因-疾病网络的构建

将TQHXD各药物成分作用靶点与AD芯片数据差异基因进行取交集，得到TQHXD治疗AD的关键作用靶点（药物-疾病靶点）。运用Cytoscape 3.7.2软件绘制药物活性成分-靶点-疾病（AD）之间的相互作用网络图。

1.4 TQHXD治疗AD的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建和核心靶点筛选

将TQHXD作用靶点与AD差异基因取交集后上传至String数据库（https://cn.string-db.org），物种选择人类（homo sapiens），靶点直接的最低联系分数＞0.4，设置隐藏不与其他靶点相联系的靶点，得到蛋白质间相互作用信息，构建PPI网络图。将String数据库分析结果导入Cytoscape 3.7.2软件进行网络拓扑学分析，筛选核心靶点。筛选标准包括Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、Local Average Connectivity-based method（LAC）、Network（NC），只有靶点分值均大于节点中位数时将其定义为核心靶点。

1.5 TQHXD治疗AD分子靶点基因本体（GO）富集分析

通过R 4.1.2软件，应用clusterprofiler包对TQHXD治疗AD的潜在靶点进行GO富集分析，以P＜0.05为筛选条件获取生物进程（biological process,BP）、细胞组分（cellular component,CC）、分子功能（molecular function,MF）富集分析数据。根据基因富集数目和显著程度（pvalue Cutoff＜0.05），选取排名前20的结果，绘制TQHXD治疗AD分子靶点的GO富集分析气泡图。

1.6 TQHXD治疗AD分子靶点基因京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析和基因-KEGG网络构建

通过R 4.1.2 软件，应用clusterprofiler包对TQHXD治疗AD潜在靶点进行KEGG通路富集分析，根据基因富集数目和显著程度（pvalue Cutoff＜0.05），选取排名前20的结果绘制TQHXD治疗AD分子靶点的KEGG通路富集分析气泡图。KEGG通路富集分析结果导入Cytoscape 3.7.2软件，根据Degree值绘制KEGG通路-基因网络图。

1.7 分子对接

将1.4中筛选出的核心靶点通过RCSB蛋白质结构数据库（PDB）（https://www.rcsb.org/）下载蛋白受体的PDB格式文件。使用Pymol软件对蛋白受体进行去水、加氢、删除配体、调整电荷等处理。通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载与核心靶点对应的中药有效成分（小分子配体）的2D结构文件，应用Chemoffice软件将2D结构转换为3D结构。将蛋白受体和小分子配体导入Auto Dock Vina 软件进行分子对接，利用 PyMol 软件绘制对接结果图。

2 结果

2.1 TQHXD活性成分与靶点

共获得TQHXD各药物的活性成分共125个，其中赤芍29个，川芎7个，葱6个，大枣29个，红花22个，生姜5个，麝香4个，桃仁23个。见表1。去除重复值得到TXHXD有效成分107个。各药物成分相应的靶点分别为赤芍158个，川芎42个，葱88个，大枣435个，红花449个，生姜75个，麝香24个，桃仁139个（补充材料1）。对靶点进行基因注释，删除重复值，得到TQHXD靶点236个。

表1 TQHXD各药物的活性成分

2.2 AD差异基因分析结果

GEO数据库下载AD数据集GSE33000和对应的注释文件GPL4372，利用R软件及相关软件包对数据进行过滤及标准化、注释，筛选差异基因。得到对照组与AD组1 262个差异基因，其中678个上调，584个下调。见图1。

图1 GSE33000基因芯片中对照组和AD组的基因差异表达火山图

2.3 TQHXD治疗AD的活性成分与靶点网络

通过Cytoscape软件对TQHXD的8 味中药及其107个活性成分，236个靶点基因进行网络构建及可视化。见图2。网络结构中共有 59 个节点，31个活性成分作用靶点，共有89条边代表靶点和有效成分之间的相互作用。

图2 TQHXD治疗AD的药物成分-靶点-疾病网络

2.4 TQHXD治疗AD的PPI网络与核心靶点筛选

将TQHXD治疗AD潜在靶点与AD差异基因取交集后，得到31个交集基因（图3），将交集基因列表导入String数据库绘制PPI网络图。见图4。在所得网络的基础上使用Cytoscape软件中CytoNCA插件构建拓扑网络，通过前文方法中所述筛选标准，共筛选到3个靶点NFKBIA、IL6、CCL2位于网络的核心位置。见图5。

图3 TQHXD潜在靶基因与AD差异基因的韦恩图

图4 TQHXD治疗 AD分子靶点的PPI网络

图5 PPI网络核心基因筛选

2.5 TQHXD治疗AD基因GO富集分析

GO富集分析结果显示在分子功能方面，靶点涉及神经递质受体活性（neurotransmitter receptor activity）、突触后神经递质受体活性（postsynaptic neurotransmitter receptor activity）、儿茶酚胺结合（catecholamine binding）、NAD-视黄醇脱氢酶活性（NAD-retinol dehydrogenase activity）、DNA结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）功能等。在生物过程方面这些靶点涉及细胞对氧化应激的反应（cellular response to oxidative stress）、对活性氧的反应（response to reactive oxygen species）、氧化应激反应（response to oxidative stress）、细胞对化学应激反应（cellular response to chemical stress）等，分别选取前20条GO条目绘制气泡图。见图6。

图6 GO富集分析

续表1

续表1

2.6 TQHXD治疗AD基因KEGG富集分析及基因-通路网络

共富集到85条通路关系，这些通路涉及TNF-α、脂质和动脉粥样硬化、Legionellosis、Pertussis、流体剪切应力信号通路（图7）。将KEGG通路导入Cytoscape 软件，取前20条通路，根据Degree值大小，显示通路与基因的富集程度，绘制通路基因网络图（图8）。KEGG通路基因网络图中基因节点的面积越大表示该基因参与的通路越多。根据Degree值，在网络中排名前5位的基因为：RELA、MAPK8、

图7 KEGG富集分析

图8 TQHXD治疗AD的KEGG通路与基因网络

NFKBIA、IL6、CLCX2。

2.7 分子对接

由交集靶点的PPI核心网络可知，NFKB1A、IL6、CCL2为TQHXD治疗AD的重要靶点，通过与活性成分-疾病靶点网络取交集，得到MOL000098（quercetin）、MOL000006（luteolin）、MOL001002（ellagic acid）、MOL001924（paeoniflorin）是TQHXD治疗AD的关键成分。通过TCMSP数据库下载4个活性成分的2D结构，应用Chem Office软件将2D结构转换为3D结构。通过PDB数据库分别下载NFKBIA、IL6、CCL2的晶体结构1IKN（NFKBIA）、1ALU（IL6）、1DOK（CCL2），借助Auto Dock Vina软件进行分子对接。结果表明，网络中的关键化合物均与相应的蛋白具有较强的亲和力。见表2。借助PyMol软件将对接结果进行可视化。见图9。

图9 分子对接

表2 分子对接能量

3 讨论

AD是一种复杂的进行性神经退行性疾病，由于涉及多个病理生理过程，目前仍缺乏有效的治疗方法。在中医理论体系中，AD属于“呆病”“健忘”等范畴，是由髓海空虚、脑神失养、神机失用而引发的神志功能异常性疾病。治法主要为补肾益精，益气健脾，化痰祛瘀等[8]。TQHXD为清代名医王清任所创，具有通窍醒神，活血化瘀之功效，多项临 床研究表明TQHXD能改善患者认知功能。

本研究通过设置ADME规则获得TQHXD的107个有效成分，进一步与GEO芯片AD差异表达基因的联合分析，得到TQHXD治疗AD的31个作用靶点。通过将31个靶点构建PPI网络及网络拓扑学分析筛选得到TQHXD治疗AD的3个核心基因

NFKBIA、IL6、CCL2。

NFKBIA基因编码IKBα，静息状态下的IkBα与p65结合，遮蔽p50蛋白的核定位信号，此时NF-kB在细胞质内处于失活状态。当细胞受到LPS、ROS、TNF-α等刺激时，IKBα在蛋白酶体作用下降解，随即与p50/p65异源二聚体解离，获得自由的p50/p65异源二聚体迅速进入细胞核中，启动靶基因，参与及调节各种生理及病理过程。经尸检发现，AD患者脑组织中NF-kB活性升高，并且在退变神经元和老年斑邻近的神经元及胶质细胞内检测出p65蛋白的免疫活性。LPS可激活小胶质细胞，经过一系列级联反应诱导小胶质细胞中的NF-kB p65亚基的核移位，从而促进炎症因子（IL-1β、IL-6、Cox-2和TNF-α）的产生[9]。被激活的NF-kB从细胞质迁移到细胞核，通过结合特定的DNA启动序列调控如反应性炎症相关基因转录，从而加重AD患者的神经病理损伤[10]。趋化因子CCL2又被称为单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1），是趋化因子家族最重要的成员之一。研究发现患者血清及脑脊液中的CCL2增高与神经退行性疾病进展相关。CCL2可招募、促进小胶质细胞分化增殖，并可影响小胶质细胞释放炎症因子，加速小胶质细胞介导的β-淀粉样蛋白异常聚集物形成，加速认知障碍的进展[11]。研究证实抑制CCL2的表达可减少小胶质细胞的激活，减轻β-淀粉样蛋白的沉积，改善小鼠认知功能[11]。IL6是一种多功能细胞因子，在调节免疫应答、炎症及机体防御机制中起着重要作用。一项Meta分析显示，AD患者外周血IL-6水平较对照组显著升高，且与简易智力状态检查量表（MMSE）评分正相关[12]。IL6基因敲除（knock out,KO）小鼠在被动回避和八臂迷宫测试中较野生型（wild type,WT）小鼠表现出更少的工作记忆错误[13]。IL6的存在可增强N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）和β-淀粉样蛋白诱导的神经元损伤[14]。IL6还可通过cdk5/p35、JAK-STAT等途径增加tau过度磷酸化[14]。在β-淀粉样蛋白沉积的情况下，小胶质细胞和星形胶质细胞释放IL-6，进一步加速AD的病理级联[15]。

AD的发生发展是多个分子、多条信号通路对多种细胞生物学行为进行调节的结果。本研究通过基因富集分析获得111个GO条目和85个KEGG通路。GO富集分析显示TQHXD治疗AD机制涉及对活性氧的反应、细胞对化学应激反应、神经递质受体活性、突触后神经递质受体活性、儿茶酚胺结合、NAD-视黄醇脱氢酶活性、DNA结合转录因子结合等生物过程。TQHXD治疗AD涉及TNF-α信号通路、脂质和动脉硬化等信号通路。TNF-α可以激活星形胶质细胞为反应性星形胶质细胞，驱动神经炎症过程，神经炎症进一步导致淀粉样蛋白β沉积的增加。TNF-α与白细胞介素-1、干扰素-γ等可通过MAPK途径诱导γ-分泌酶裂解淀粉样前体蛋白[16]。TNF-α还可刺激NF-kB信号通路，从而增加淀粉样蛋白的生成[17]。本研究发现，除了炎症通路，TQHXD治疗AD还涉及脂质和动脉粥样硬化通路。大脑中富含大 量的脂质，AD与脂质的稳态破坏有关，早、中期AD患者脑组织存在脂质过氧化，胶质细胞中脂质颗粒增多[18]。AD患者血脂中HDL-C、LDL-C、TC及TG均出现代谢异常[19]。服用他汀类药物可显著降低AD的发病率，亦从侧面证实脂代谢异常与AD的相关性[20]。本研究通过GO、KEGG富集分析再次证明了TQHXT治疗AD的多通路、多靶点作用。

分子对接通过评估网络中小分子与蛋白配体的结合能来评估分子间的相互作用，从而提高网络的准确性[21]。为验证筛选的核心靶点可靠性，对3个核心靶点与之对应的活性成分进行分子对接，计算结合能评价结合活性。本研究分子对接结果显示，TQHXD的4个核心成分与3个核心靶点均能有效对接。其中quercetin与3个核心靶点均有良好的结合能力。quercetin属于类黄酮中的黄酮醇类，多项体外、在体研究发现其有显著的抗炎功效[22]。quercetin可下调LPS诱导的细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达[23]，干扰β-淀粉样蛋白寡聚体的形成，还可破坏β-淀粉样蛋白纤维的稳定性，逆转β-淀粉样蛋白诱导的神经毒性[24]。quercetin通过抑制BCAE-1的第3位碳原子上的氢键形成从而抑制BCAE-1的活性，减少β-淀粉样蛋白的生成[25]。此外quercetin还可通过抑制NF-kB间接调节APP的β裂解减少β-淀粉样蛋白的生成[26]。长期口服quercetin可显著减少 3xTg-AD模型小鼠海马和杏仁核的β-淀粉样蛋白和减轻tau蛋白磷酸化趋势，改善小鼠在高架十字迷宫中的表现[27]。分子对接结果进一步验证了筛选的TQHXD治疗AD核心网络的准确性。

本研究通过网络药理学分别从药物疾病靶点预测，差异基因筛选，PPI网络构建，GO、KEGG富集分析等方面探究TQHXD治疗AD的分子机制，最后通过分子对接，验证了TQHXD有效成分与其作用靶点的良好结合活性。中药治疗AD从整体观念出发，具有多靶点、多通路的优势，为TQHXD用于AD临床治疗提供了理论基础。

综上所述，TQHXD可能通过参与炎症信号通路及相关生物功能作用于NFKBIA、IL6、CCL2等疾病靶点，发挥治疗AD作用。