黑曲霉果胶酯酶在毕赤酵母中异源表达、性质分析及脱酯工艺优化

孙莹，吴丹，郑璞，陈鹏程

(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

果胶又称聚甲氧基半乳糖醛酸，以原果胶、果胶酸和果胶的形式存在于植物中，具有良好的胶凝性、乳化性和增稠性。这3种果胶类物质的区别与甲酯的含量有关[1]。果胶分子主链上的半乳糖醛酸残基在C-6位可被酯化为甲酯，甲酯化半乳糖醛酸与总半乳糖醛酸摩尔数之比称为酯化度(degree of esterification，DE)[2]。食品化学法典规定：DE>50%的果胶称为高酯果胶(high methoxyl pectin，HMP)，反之称为低酯果胶(low methoxyl pectin，LMP)。LMP可以通过将HMP进行脱酯得到，脱酯法有化学法和酶法。化学法具有成本高、工艺控制繁琐、污染环境等缺点。与化学法相比，酶法脱酯制备的LMP具有质量高，得率高和绿色环保等优点[3]。HMP和LMP在工业中最重要的应用是凝胶作用，二者的凝胶机理不同[4]。HMP在含糖量高于55%和pH在2.0～3.5的条件下才可形成凝胶，通常用于高糖含量食品的生产，不利于糖尿病患者等特殊人群的使用，应用受到限制[5]。LMP则不受体系pH和可溶性固形物含量影响，在较低糖含量甚至无糖条件下，只要Ca2+等二价金属阳离子存在即可形成凝胶，主要用于低糖食品的生产，符合现代人们降油降糖、健康饮食的需求，因而具有广阔的市场前景[6]。

果胶酯酶(pectinesterase，PE，EC 3.1.1.11)，属于羧酸酯水解酶系，是果胶酶三大组分之一[7]。PE能够从果胶分子的还原性末端或者邻近的游离羧基开始，定向攻击甲氧基，进行去甲基化反应，生成果胶酸，从而将HMP转化为LMP，属于皂化酶[8]。PE广泛存在于植物和微生物中，在植物中，主要存在于根、茎、叶和果实等中，在微生物中，PE主要存在于真菌(如曲霉菌)和细菌(如假单胞菌)[9]，此外，在一些植物致病菌(如导致植物软腐病的欧氏杆菌)中也发现了PE[10]。PE被广泛应用于食品加工，改善果胶在水中的溶解度，提高果蔬汁的出汁率，提高果汁果酒的澄清度等，还用于化妆品、制药、造纸等行业。此外，PE也是一些植物病原体侵染植物的关键酶[11]。

20世纪60年代起，国内开始进行PE的来源、生物学特性、酶学性质及工业应用等方面的研究。尽管对PE已有了一定的研究，但目前国内外仍未实现酶法制备LMP的工业化生产，主要原因是国内目前研究的PE存在表达量低、酶活力低、热稳定性差等缺点[12]，限制了酶法制备LMP的工业化生产。目前尚未有专门用于脱酯的商品PE，市售的果胶酶大多是PE、聚半乳糖醛酸酶和果胶酸裂解酶的混合物，国内的PE市场受到Sigma等国外大型公司的限制，昂贵的价格也限制了我国酶法脱酯的工业发展[13]，因此对PE进行重组表达以提高其表达量及改善其酶学性质具有重要的意义。

本研究根据毕赤酵母(Pichiapastoris)X33的密码子偏好性，对黑曲霉(Aspergillusniger)来源的PE基因进行密码子优化，并实现其在P.pastorisX33中的异源表达，分离纯化获得纯PE，研究了其酶学特性，并对该酶的脱酯工艺条件进行优化，以期为促进酶法制备LMP的工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

菌株EscherichiacoliJM109、PichiapastorisX33、质粒pPICZαA均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器

主要试剂：HMP，上海麦克林生化科技有限公司；博莱霉素(ZeocinTM)，北京索莱宝科技有限公司；PrimeSTAR®Max DNA Polymerase、Premix TaqTM，大连宝生物工程有限公司；一步克隆试剂盒、T4 DNA连接酶、核酸分子质量Marker，诺维赞有限公司；质粒小提中量试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯或化学纯。

主要仪器：PCR仪、蛋白电泳系统，美国伯乐生命医学产品有限公司；电转仪，德国艾本德股份公司；核酸电泳仪，北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；碱式滴定管，扬州市葵花玻璃厂。蛋白纯化系统，美国通用电气医疗集团。

1.1.3 培养基

LB(Luria-Bertani)、酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)、酵母浸出粉胨甲醇(yeast extract peptone methanol，YPM)、BSM培养基均参照Invitrogen公司操作手册推荐的方法进行配制。

1.2 实验方法

1.2.1 表达载体pPICZαA-pe的构建

根据P.pastorisX33的密码子偏好性，对黑曲霉PE基因(Genbank：XP_025519631.1)进行密码子优化，由天霖生物科技(上海)有限公司合成，并克隆至pUC57质粒中得到pUC57-pe重组质粒，以该重组质粒为模板，通过PCR反应得到优化后的果胶酯酶基因pe。同样地，以质粒pPICZαA为模板进行PCR扩增，通过胶回收获得载体片段。使用一步克隆试剂盒将pe基因与pPICZαA进行连接，连接产物转化感受态细胞E.coliJM109，涂布LB平板(含0.1 g/L ZeocinTM)，37 ℃过夜培养后挑取单克隆进行菌落PCR反应，挑取阳性转化子接种至LB液体培养基振荡培养12～16 h后提取质粒进行酶切验证，将酶切结果正确的质粒送天霖生物公司进行测序，测序无误的质粒命名为pPICZαA-pe。

1.2.2 重组菌株X33的构建与摇瓶发酵

本研究采用P.pastorisX33作为表达宿主，使用SacⅠ将重组质粒pPICZαA-pe进行线性化，用PCR产物纯化试剂盒回收纯化片段，随后电击转化至P.pastorisX33感受态细胞中，涂布YPD平板(含0.1 g/L ZeocinTM)，30 ℃培养至出现单菌落即为重组菌株X33。挑取重组菌单菌落接种至YPD液体培养基中，30 ℃，220 r/min培养24 h 后于4 ℃，5 000 r/min离心10 min，去除上清液得到菌体。转接至YPM培养基中进行PE的诱导表达，30 ℃，220 r/min培养72 h，每隔12 h添加终体积分数为1%的甲醇。诱导结束后，发酵液经4 ℃，7 000 r/min离心5 min后取上清液即得到PE粗酶液，对粗酶液的酶活力和蛋白浓度进行测定，通过筛选，选择酶活力最高的1株重组菌株用于3 L罐高密度发酵。

1.2.3 酶活力的测定

参考GONZALEZ等[14]的方法并做出改进，采用碱滴定法。将30 mL 1 g/L的果胶溶液(pH 5.0 0.1 mol/L柠檬酸-0.2 mol/L Na2HPO4缓冲液)在37 ℃水浴摇床预热10 min，加入1 mL待测PE液，置于37 ℃水浴摇床反应10 min，煮沸10 min灭活，用0.01 mol/L NaOH溶液滴定pH至9.0。以煮沸灭活的酶液作对照。酶活力定义为：在37 ℃、pH 5.0条件下，每分钟作用果胶产生1 μmol羧基所需的酶量定义为1个酶活力单位。

1.2.4 酶学性质分析

将摇瓶发酵得到的PE粗酶液经阴离子交换柱分离纯化后获得的纯PE进行酶学性质分析。

最适反应条件分析：用0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液分别配制pH 2.0～8.0的底物溶液，在37 ℃下测定PE在不同pH体系中的酶活力，以最高酶活力为100%，比较各pH条件下的相对酶活力，确定最适反应pH。在最适反应pH条件下，测定30～85 ℃的酶活力，以最高酶活力为100%，确定最适反应温度。

稳定性分析：将纯PE置于不同pH(2.0～8.0)的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中，4 ℃静置2 h，用pH 5.0的上述缓冲液调节pH至5.0后在最适条件下测定残余酶活力，以未处理的PE的酶活力为100%，分析酶的pH稳定性。将纯PE分别在35、45、55、65、75 ℃下保温100 min，每20 min取样，立即置于冰浴中冷却，在最适条件下测定残余酶活力，以未经处理的PE的酶活力为100%，分析酶的温度稳定性。

动力学参数分析：在最适反应条件下测定PE在不同浓度HMP溶液下的酶活力，采用Lineweaver-Burk双倒数法，以底物浓度的倒数为横坐标、酶活力的倒数为纵坐标，绘制酶动力学参数曲线。根据与坐标轴的交点，其中横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax，计算出PE的米氏常数Km和最大反应速率Vmax。

1.2.5 重组菌株X33的3 L罐高密度发酵

挑取经筛选得到的1株重组菌单菌落接种至100 mL YPD液体培养基中，30 ℃，220 r/min培养至OD600值为10～12后，以10%接种量接种至含900 mL BSM培养基的3 L发酵罐中进行高密度发酵。生长期的发酵参数为：温度30 ℃、转速220 r/min、溶氧(dissolved oxygen，DO)20%，使用浓氨水调节pH至5.5，培养至DO反弹(一般DO>60%)，进入补料分批培养阶段，开始使用含有12 mL/L PTM1的500 g/L的甘油进行流加，待OD600达到100时，停止甘油的流加，进行饥饿培养，待DO再次反弹时，开始使用含有12 mL/L PTM1的甲醇进行诱导表达阶段，诱导产PE，同时，设置诱导温度为28 ℃，使用甲醇检测流加控制器控制甲醇体积分数在0.5%，甲醇诱导开始后，每隔12 h取样测定酶活力，诱导96 h后OD600达到500以上时终止发酵。

1.2.6 果胶酯化度的测定

称取0.1 g果胶，移入100 mL锥形瓶中，加入0.4 mL乙醇润湿，加入20 mL ddH2O，封口转动使其完全溶解(时间不宜过久)，滴3滴5 g/L的酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微红色，记录空白和样品所耗NaOH的体积(V0、V1)，即为原始滴定度。继续加入20 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，封口后强烈振摇20 min，加入20 mL 0.5 mol/L HCl溶液，充分振摇至红色消失，然后加入3滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微红色，记录所耗NaOH体积(V2)，按公式(1)计算酯化度[15]。

(1)

1.2.7 PE的脱酯工艺条件优化

以脱酯率为指标，采用控制变量法，进行单因素试验，反应体系为50 mL，分别考察果胶浓度、加酶量、反应温度、初始pH及脱酯时间对酶法脱酯反应的影响。

选择10、20、30 g/L三个果胶质量浓度(pH 5.0)，每个果胶浓度分别选择7个加酶量：32.7、65.4、98.1、196.2、392.4、784.8、981 U/g，65 ℃下水浴振荡反应3 h，反应结束后，测所得LMP的酯化度。

采用已经优化的果胶浓度和加酶量，分别配制pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的果胶溶液，65 ℃下水浴振荡反应3 h，反应结束后，测所得LMP的酯化度。

采用已经优化的果胶浓度、加酶量和初始pH，分别在50、55、60、65、70、75、80 ℃下水浴振荡反应3 h，反应结束后，测所得LMP的酯化度。

采用已经优化的果胶浓度、加酶量、初始pH和温度，分别水浴振荡10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120 min，反应结束后，测所得LMP的酯化度。

2 结果与分析

2.1 重组PE的异源表达

以pUC57-pe质粒为模板，通过PCR扩增得到果胶酯酶基因pe，电泳结果如图1-a所示，在936 bp出现明显的DNA条带，与预期一致。以质粒pPICZαA为模板进行PCR扩增，得到载体片段，电泳结果如图1-b所示，条带大小与预期一致(3 546 bp)。利用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ对重组质粒pPICZαA-pe进行酶切验证，结果如图1-c所示，重组质粒被酶切后出现了与预期大小一致的2个DNA片段，分别为1 700和2 800 bp。构建好的质粒经测序验证正确无误后，命名为pPICZαA-pe。

M-DNA marker;a1-pe的PCR产物；b1-质粒pPICZαA的PCR产物；c1-被Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切后的质粒pPICZαA-pea-pe的PCR扩增产物电泳图；b-质粒pPICZαA的PCR扩增产物电泳图；c-重组质粒pPICZαA-pe的酶切验证电泳图图1 PCR 扩增和重组质粒酶切验证电泳图Fig.1 Identification of PCR amplification production and recombinant plasmid with agarose gel electrophoresis

使用SacI线性化pPICZαA-pe质粒后经电转化法转化至P.pastorisX33感受态细胞，涂布YPD抗性平板，30 ℃培养至出现单菌落。随机挑取9个单菌落进行摇瓶诱导表达后，离心收集发酵液上清液，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析(图2)，并测定酶活力(结果见表1)。选定摇瓶酶活力最高的7号菌株，作为3 L发酵罐高密度发酵的菌株。

1～9-1～9号重组菌株的发酵液上清液图2 不同菌株的发酵液上清液SDS-PAGE图Fig.2 SDS-PAGE of supernatants from different strains

表1 重组PE摇瓶水平酶活力Table 1 Recombinant PE activities in shake flask

2.2 PE的3 L发酵罐高密度发酵

挑取7号重组菌株的单菌落接种至100 mL YPD液体培养基中，培养至OD600达到10～12。按照10%接种量，接种至装有900 mL BSM培养基的3 L发酵罐中，进行高密度发酵，由于发酵过程除了初始的甘油培养阶段，还有后续的甘油流加阶段以及甲醇的诱导表达阶段，一开始装入太多培养基，后期会导致发酵液太满而溢出发酵罐，无法继续进行高密度发酵；其次，发酵过程全程自动流加氨水以保障酵母生长的最适pH，培养基太多会限制转速从而影响溶氧，进而影响酵母的生长和酶的表达。甲醇诱导开始后，每隔12 h取样，离心保留上清液，诱导96 h后停止发酵。对经不同诱导的发酵液上清液进行SDS-PAGE分析(图3-a)，并测定酶活力和OD600值(图3-b)。在发酵过程中，诱导96 h后，OD600达到435，84～96 h的OD600基本不变，重组PE的酶活力随诱导时间的增加而提高，最终达到85.12 U/mL，相比于摇瓶表达最高酶活力(12.16 U/mL)提高了6倍。

a-不同时间发酵液上清液SDS-PAGE图；b-发酵过程中酶活力和OD600曲线图图3 重组毕赤酵母3 L发酵罐发酵指标图Fig.3 Recombinant P.pastoris fermentation process in 3 L bioreactor

2.3 重组PE的酶学性质研究

2.3.1 最适pH及pH稳定性

重组PE的最适反应pH如图4-a所示。重组PE在pH 5.0时的酶活力最高，在pH 4.5～5.5，仍有90%以上的酶活力；当pH从5.5升高至8.0时，酶活力迅速降低，pH 8.0时，仅有8.3%，说明该酶是一种偏酸性酶。pH稳定性如图4-b所示。重组PE即使在pH 3.5～6.5的酸性条件下孵育2 h后，仍具有60%以上的酶活力，但在pH 8.0孵育2 h后，其酶活力下降较多，仅有25%，说明该PE在碱性条件下的稳定性较差。

a-最适pH；b-pH稳定性图4 pH对重组PE活性和稳定性的影响Fig.4 Effect of pH on activity and stability of recombinant PE

2.3.2 最适温度及温度稳定性

重组PE的最适反应温度如图5-a所示。重组PE的最适反应温度为55 ℃，在45～65 ℃时PE的相对酶活力保持在75%以上，55 ℃时具有最高酶活力，高于65 ℃时，酶活力迅速降低，温度达到85 ℃时，PE失活。温度稳定性如图5-b所示，重组PE在35～55 ℃相对比较稳定，35 ℃下处理100 min，仍保持60%的酶活力；55 ℃下处理60 min，保持50%的酶活力，65 ℃下处理20 min，酶活力降低至25%，处理60 min，酶活力降低至8%；75 ℃下处理40 min即失去酶活力。说明该PE在低温(35 ℃)下具有较好的稳定性。

a-最适温度；b-温度稳定性图5 温度对重组PE活性和稳定性的影响Fig.5 Effect of temperature on the activity and stability of recombinant PE

2.3.3 PE动力学参数测定

用0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液分别配制质量浓度为2、4、6、8、10、12 g/L的HMP溶液，以其为底物，对纯化后的PE液适当稀释后，与不同浓度的底物在最适条件下进行酶解反应，测定PE的活力。采用Lineweaver-Burk双倒数法作图，得到曲线方程y=1.523 8x+0.110 6，R2=0.998 6。根据曲线方程可计算出该PE的米氏常数Km为13.8 mmol/L，最大反应速率Vmax为9.04 μmol/(L·min)。

2.4 PE的脱酯工艺优化

2.4.1 果胶浓度和酶量对脱酯的影响

选择10、20、30 g/L三个果胶质量浓度(pH 5.0)，每个果胶浓度选择32.7、65.4、98.1、196.2、392.4、784.8、981 U/g，7个加酶量水平，65 ℃下脱酯3 h，由图6可知，果胶质量浓度为10 g/L时，果胶的酯化度随加酶量的增加而降低，加酶量为981 U/g时，酯化度最低，为20.4%。果胶质量浓度为20 g/L时，加酶量在32.7～392.4 U/g时，果胶酯化度随加酶量的增加而降低，加酶量为392.4 U/g时，酯化度最低，为22.2%，此后，随加酶量的增加酯化度反而提高。果胶质量浓度为30 g/L，加酶量为65.4 U/g时，酯化度最低，为23.5%，此后，随加酶量的增加，酯化度升高。在较高果胶浓度下，随着加酶量的增加，酯化度反而增加的原因可能是脱酯果胶的反馈抑制，随着加酶量增加，脱酯果胶浓度增加，反而抑制了PE的活性。综上考虑成本及工艺，选择30 g/L果胶、加酶量65.4 U/g，进行下一步的工艺条件优化。

图6 果胶浓度和加酶量对脱酯的影响Fig.6 Effect of pectin concentration and enzyme amount on de-esterification

2.4.2 初始pH对脱酯的影响

在30 g/L果胶和加酶量为65.4 U/g条件下，选择pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，65 ℃下脱酯3 h，结果如图7所示。酶法脱酯的最适pH为5.5。在pH 3.5～5.5范围内，随着pH的增加，果胶的酯化度降低，pH 5.5时，酯化度最低，为20.8%，此后，随着pH的增加，酯化度升高。在pH 4.5～6.0，脱酯效果较好，酯化度在23%左右，这可能与该PE的偏酸性等电点(pI 4.16)有关。在pH 3.5～6.5，酯化度最高，为24.6%，最低为20.8%，酯化度相差较小，表明初始pH对酶法脱酯的影响较小。综上，选择pH 5.5进行下一步的工艺条件优化。

图7 初始pH对脱酯的影响Fig.7 Effect of initial pH on de-esterification

2.4.3 反应温度对脱酯的影响

在30 g/L果胶、加酶量为65.4 U/g、pH 5.5条件下，分别选择45、50、55、60、65、70、75 ℃脱酯3 h，结果如图8所示。酶法脱酯的最适温度为50 ℃。在45～75 ℃，果胶的酯化度呈现V型变化，在50 ℃时脱酯效果最好，此时酯化度为18.2%。此后随着温度的升高酯化度增加。原因是随着温度的升高，PE活力降低，脱酯率随之下降，酯化度增加。脱酯温度对脱酯效果影响较大。综上，选择反应温度50 ℃进行下一步的工艺条件优化。

图8 反应温度对脱酯的影响Fig.8 Effect of reaction temperature on de-esterification

2.4.4 反应时间对脱酯的影响

在30 g/L果胶、加酶量为65.4 U/g、pH 5.5、50 ℃条件下，分别于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min进行脱酯。由图9可知，酶法脱酯的最适反应时间为60 min。在10～120 min，果胶的酯化度呈现V型变化，在60 min时酯化度最低，为13.6%，PE脱脂效果最好。故选择60 min为最佳反应时间。在10～60 min，酯化度随时间的增加而降低。60 min后，随时间的增加酯化度反而提高。该结果与姚小丽[16]的研究一致，在最适脱酯时间的基础上延长反应时间，酯化度反而增加。猜想脱酯反应可能是可逆反应，时间的延长反而加速了逆反应的进行，但酶法脱酯过程是否是可逆过程还需进一步研究。

图9 反应时间对脱酯的影响Fig.9 Effect of reaction time on de-esterification

3 讨论与结论

本研究将来源于黑曲霉的果胶酯酶基因pe在P.pastorisX33成功实现高水平分泌表达，通过高密度发酵得到的粗酶液的酶活力达到85.12 U/mL，是目前报道的PE异源表达最高酶活力水平，较好解决了一直以来PE活力较低的问题。同时重组PE广泛的pH稳定性和较好的温度稳定性表明了其在工业应用方面的良好潜力。本研究所获得的PE在优化的最佳脱酯工艺条件下进行脱脂得到酯化度为13.6%的LMP，是目前所有酶法脱酯制备LMP相关报道中脱酯率最高、酯化度最低的实验结果，在酶法制备LMP的工业应用方面具有较好的应用意义。