细菌整合子检测方法研究进展

郝佳慧， 杨泽华

（1.山西医科大学第一临床医学院，山西 太原 030001；2.山西医科大学第一医院检验科，山西 太原 030008）

20世纪80年代，澳大利亚学者在研究耐药质粒和转座子的过程中发现了整合子，并于1989年首次报道，他们认为整合子是一种新的抗性决定基因[1]。1991年，HALL等[2]提出整合子-基因盒系统概念，认为整合子-基因盒系统介导了微生物对多种抗菌药物的耐药。目前，约有130个不同的基因盒已经被鉴定出来，且大部分基因盒都在抗菌药物耐药性方面起到了一定作用。整合子是一个可移动的遗传元件，其基本组件包括整合酶基因intI、重组位点attI和启动子Pc。在抗菌药物选择压力下，整合酶基因编码整合酶蛋白切除和整合耐药基因盒，使耐药基因盒插入到重组位点attI，启动子Pc启动耐药基因盒的转录与后续表达，使细菌获得耐药性。在其他选择压力下，整合子还可以捕获不同功能的基因盒，在细菌基因组进化中也发挥着重要作用。所以，尽早判断细菌是否携带整合子，可以更好地掌握细菌的耐药情况。确定细菌中的整合子一般是通过检测整合子的整合酶基因和可变区基因盒，主要检测方法包括基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的各种方法、环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、宏基因组测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）、基因芯片等分子生物学方法。本文对上述方法和非典型1类整合子检测方法的原理、特点和应用进行介绍，为临床实验室准确检测细菌中的整合子，预判细菌耐药提供参考。

1 基于PCR的整合子检测

1.1 常规PCR

PCR技术是模拟DNA的天然复制过程，通过变性、退火、延伸3个步骤来扩增特定的DNA片段的一种方法，每完成1个循环需要2～ 4 min，2～3 h就能将待扩增目的基因扩增几百万倍。基于PCR扩增技术的原理，可根据整合酶基因设计引物，选择合适的扩增条件扩增整合酶，从而判断整合子的携带情况[3]。除此之外，PCR可以通过扩增整合子可变区来检测整合子，针对5'-CS和3'-CS之间含有抗性基因盒的内部可变区设计特异引物，并进行扩增，鉴定细菌中的整合子[4]。2001年，KOELEMAN等[5]对采用PCR技术扩增整合酶和整合子可变区这2种方法进行了比较，发现整合酶基因的PCR检测与整合子可变区PCR检测相比，可多检测到2个整合子，原因可能是细菌的整合子可变区不携带基因盒，或者携带的基因盒数量超过了PCR的扩增能力，从而造成整合子的漏检。提示整合子PCR通过扩增可变区检测整合子可能造成假阴性。因此，整合酶PCR检测似乎是一种快速而简单的方法，可以用于常规筛查细菌中的整合子。目前，大部分细菌整合子的检测主要是通过PCR扩增整合酶基因，对扩增阳性的菌株再进行可变区基因盒的扩增，然后对可变区阳性菌株进行测序，得到基因盒具体序列和排列顺 序[6-10]，从而发现新的耐药基因盒。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应（r e a ltime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）

RT-qPCR是把荧光染料或探针加入反应体系中，通过荧光信号对PCR进程进行实时监测，记录每个循环后扩增产物量的变化，最后通过循环阈值和标准曲线对未知模板进行定量分析。2017年，车洁等[11]利用小沟结合物（minor groove binder，MGB）探针标记技术，将intI基因和ISCR1元件的检测融合到1个扩增反应体系中，建立了一套双元件二重RT-qPCR方法，可在1个反应管里同时检测intI基因和ISCR1元件这2种多药耐药相关基因，且仅需40 min，检测灵敏度均在101拷贝/μL数量级。BARRAUD等[12]对引物-探针定量PCR检测整合子的方法进行了验证和评估，发现每对引物-探针对相应的intI基因都是特异的，不含整合子的菌株和含超级整合子的弧菌菌株均未获得信号，所有含有整合子的菌株均获得了特异性扩增信号；他们还发现，荧光定量PCR可以准确测出模板的浓度，而普通PCR只能对模板进行定性或半定量测定；荧光定量PCR比普通PCR检测细菌中整合子耗时更短，可免去凝胶电泳成像过程，快速检测整合子，非常适合用于对大量多重耐药细菌整合子的初筛。

1.3 多重PCR

多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一反应体系中加入最少2对引物，可同时扩增多个核酸片段，其反应原理和过程与普通PCR类似，一般使用多重PCR技术在1个PCR体系中加入1、2和3类整合酶基因的上、下游引物，检测细菌是否存在1、2和3类整合子[13]。TEWARI等[14]针对intI 1、intI 2和intI 3整合酶基因设计引物，通过多重PCR检测78株大肠埃希菌携带整合子的情况，发现有1株同时含有2类和3类整合子。刘旭等[15]为了建立一种能同时检测1类整合子、4类超级整合子和1型插入序列共同区的多重PCR检测方法，设计了3对特异性引物，还通过对单引物灵敏度检测和退火温度的不断测试，优化了引物最佳浓度和最佳退火温度。引物是影响多重PCR目的片段成功扩增的关键，不同的引物在同一PCR体系中灵敏度不同，彼此会形成一种竞争关系，可能会互相抑制。因此，对不同基因引物浓度的选择至关重要。目前，检测整合子的方法多为单基因PCR检测，即检测1种整合酶基因[16]。然而，单基因PCR检测可能会造成漏检，特别是当有2种或2种以上整合酶基因同时存在时；且单基因PCR检测成本高、耗时长；而多重PCR可以同时扩增多个基因，克服了单基因PCR的缺点，从而缩短了检测时间，降低了成本。

1.4 简并聚合酶链反应（degenerate oligonucleotide primed-polymerase chain reaction，DOP-PCR）

DOP-PCR是根据遗传密码具有简并性设计简并引物，然后进行PCR扩增，一般是根据整合酶基因的保守序列设计1、2和3类整合酶基因的简并引物，检测细菌携带的3类整合酶基因，并使用限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切分析，根据酶切片段的大小来判断所携带整合酶的类型[17]。有研究者设计了DOP-PCR引物hep35和hep36进行PCR扩增，用于筛查53株志贺菌中的1、2和3类整合子[18]。DOP-PCR可以同时检测1、2和3类整合酶基因[19-20]，缩短了检测时间，也降低了检测成本。虽然DOP-PCR简化了实验过程，但扩增产物仍需酶切和电泳技术才能确定分类[18]。简并引物的设计决定了PCR能否成功扩增，这一方法本身有一定的偶然性，反应条件尚需摸索，且DOP-PCR对模板也有一定要求，若模板具有很高的GC含量，经常会扩增出许多不正确片段，造成检测结果的偏差。

2 LAMP

LAMP是NOTOMI等[21]2000年开发的一种新的恒温核酸扩增方法，是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，包括2条内引物和2条外引物，在恒定温度（65 ℃）条件下，通过一种链置换DNA聚合酶进行核酸扩增。2018年，CHEN等[22]优化了高通量LAMP技术，并将其应用于整合子和耐药基因盒的检测，针对整合子上的intI 1、intI 2、intI 3和基因盒特定序列设计了内引物和外引物，仅耗时2.5 h。LAMP仅需在水浴和加热块等简易设备上分别进行加热和扩增，然后将扩增产物用SYBR Green染色，这使得实验结果仅通过观察颜色变化即可判定，大大简化了判断结果的步骤，节省了时间[23]。有学者筛选出1、2、3类整合子的特异性保守序列，设计了LAMP引物组，采用多重LAMP方法检测细菌中的整合子，结果显示，1类整合子阳性比例最高，其次是2类整合子，未检测到3类整合子，也未发现1类和2类整合子均为阳性的菌株[24]。然而，多重LAMP方法与多重PCR技术一样，在引物设计上更为复杂，同时要避免不同引物间的互相竞争导致的抑制作用，所以限制了多重LAMP方法的进一步应用。普通PCR需要经过热循环来扩增，扩增产物还需通过凝胶电泳验证[25]；LAMP技术可以在恒温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，不需要昂贵、精密的仪器，简化了实验过程，节约了实验成本。因此，LAMP方法可以用于大规模临床分离株整合子的快速筛查。

3 基因测序技术

基因测序是为了获得目的DNA片段的全部碱基序列，在分子生物学和基础医学领域应用广泛，目前已经发展到第4代，第2代、第3代和第4代测序技术统称为下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术。第1代测序技术主要基于Sanger双脱氧终止法的原理，要将提取的样品打碎成DNA片段，最后通过凝胶电泳获得序列，2次只能获得1条长度为700～1 000个碱基的序列，通量低、成本高。第2代测序也被称为高通量测序（high-throughput sequencing，HTS），有许多测序平台，1次可对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，通量高、成本低，已被广泛用于检测细菌中的整合子。有学者在巴西不同地区医院的患者身上收集了21株含KPC-KP基因的肺炎克雷伯菌，从中筛选出10株进行全基因组测序（whole genome sequencing，WGS），再利用GenBank数据库中已存入的1、2和3类整合子的整合酶基因与测得的基因序列进行比对，最后得到的WGS数据中显示有9株肺炎克雷伯菌含有1类整合子和不同的基因盒[26]。除此之外，CURY等[27]制作了一个名为IntegronFinder的程序，在全基因组序列中检索，能够准确、灵敏地识别整合子。IntegronFinder能够检测细菌基因组中的整合子和整合子相关结构[28]，且通过测序技术可以获知细菌中整合子基因盒的具体种类和序列，进而掌握细菌耐药的新进展[29-31]。随着NGS技术的快速发展，测序成本变得越来越低，临床和实验室逐渐开始大量采用测序技术解决问题。

4 非典型1类整合子的检测方法

典型的整合子系统包括3个部分，2端是一段高度保守序列，即5'-CS和3'-CS，5'-CS和3'-CS之间的区域即可变区，其间可插入不同数量的基因盒，但基因盒并非整合子的必需组成部分。1类整合子通常通过5'-CS和3'-CS设计引物，以扩增整合子的可变区[32]。然而，一般非典型1类整合子3'-CS结构异常，所以非典型1类整合子用标准引物可能无法扩增出复杂的基因盒序列。反向PCR可扩增1段已知序列两端的未知序列，扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成1个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。LEE等[33]设计了intI 1和sul 1基因的反向引物，对基因组DNA进行反向PCR分析和DNA测序，在霍乱沙门菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌中分别检测到3个异常结构——sul3相关突变整合子、缺陷型1类整合子和qnrB2相关复合体1类整合子。XIAO等[34]使用引物对INTRR和INTRF对96株1类整合子阳性菌株基因组DNA进行反向PCR分析，然后通过电泳和测序进行验证，检测到常规不能扩增的非典型1类整合子的5个可变区。以上研究均证实逆转录PCR可以用来检测含有非典型3'端的整合子，从而减少整合子的漏检，全面了解整合子的各种分型。但是，反向PCR技术的难点是需要从许多酶中选择合适的限制酶，才能酶切到合适的DNA片段。

5 其他检测方法

基因芯片技术是通过与一组已知序列的核酸探针杂交来检测核酸序列，可以快速得到所测DNA碎片的基因序列。GLENN等[35]使用结合和固定在基质上的整合子特异性寡核苷酸探针，发现29个阳性杂交产生目标DNA-探针双链，阳性杂交与PCR分析结果一致。沈瀚等[36]还开发了菌落原位杂交法，用于检测整合子，他们制备1类整合酶基因的特异性探针，利用细菌自身的繁殖对靶序列进行扩增，检测革兰阴性菌中的Ⅰ类整合酶基因。但菌落原位杂交法实验周期比较长，程序比较繁杂，影响因素也较多，因此未被广泛使用。

6 总结

在抗菌药物的选择压力下，耐药细菌的存活增加了细菌的毒性和致病性，严重影响了人类的健康。细菌整合子检测方法的研究对于早期发现整合子具有重大意义，可尽早判断细菌的进化方向。了解细菌整合子不同检测方法的优点和不足，可帮助临床实验室根据样本量和检测目的选择合适的方法。细菌整合子检测方法的研究不仅需要关注其特异性，还要考虑检测时间和成本等问题，包括其能否与试纸或试剂盒等结合，从而可以大批量检测整合子，增加实用性。为此，临床实验室应积极探索整合子的检测方法，及时发现或避免新型耐药表型的出现。