中性粒细胞胞外诱捕网相关标志物与视网膜静脉阻塞的相关性研究△

朱 玮 孟逸芳

视网膜静脉阻塞(RVO)是世界范围第二常见的视网膜血管疾病。RVO的确切发病机制尚不明了，通常认为与血栓形成、炎症和氧化应激有关，这些病理过程也参与了RVO并发症的发生与发展。包括黄斑水肿(ME)和新生血管性青光眼在内的严重并发症是导致RVO患者视力障碍甚至失明的主要原因[1]。RVO的现行治疗方式仅能减轻临床症状，无法完全逆转由血管闭塞引起的视网膜结构和视功能的损伤,且部分RVO患者的治疗效果欠佳，视力挽救效果不明显[2]。因此，我们亟待提高对RVO发病机制的认识，从而为RVO的诊断、治疗和预后提供参考。

大量证据表明，活化后的中性粒细胞可以通过特有的程序性死亡方式形成由颗粒蛋白和解聚的DNA组成的网状结构，该网状结构被称为中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)，NETs的形成过程被称为网捕死亡(NETosis)[3-4]。NETs不仅具有杀死细菌或真菌的能力，而且有助于多种生物学进程。既往研究表明，NETosis与糖尿病、高血压、心血管疾病以及中风的发病有关[5-7]，鉴于上述疾病是RVO发生的潜在危险因素，我们推断，NETs可能与RVO的发病有关。然而，关于NETs与RVO发病相关性的报道有限，因此，本研究通过测量RVO患者中游离DNA(cfDNA)、髓过氧化物酶(MPO)-DNA、瓜氨酸化组蛋白H3(H3Cit)等NETs相关生物标志物的表达，对NETs的状态进行量化，并探索NETs与炎症或血栓形成的关系，以期为NETosis和RVO发病之间的潜在关系提供重要线索。

1 资料与方法

1.1 研究对象纳入2020年1月至7月在常熟市第二人民医院眼科就诊的RVO患者77例(77眼)为RVO组。RVO的诊断依据Flaxel等[8]2019年发布的RVO眼科临床指南。对照组纳入在同一临床中心的体检部门随机选取的年龄和性别相匹配的志愿者48例(48眼)。

RVO组患者排除标准：(1)有全身炎症或血栓性疾病史；(2)有虹膜红变和葡萄膜炎病史；(3)既往RVO治疗史；(4)血液病、结缔组织病或恶性肿瘤患者；(5)无法配合研究的患者。对照组参与者排除标准：若志愿者满足任意上述标准或存在RVO病史，则排除在外。

本研究符合《赫尔辛基宣言》原则，经常熟市第二人民医院伦理委员会批准(2021-KY-0037-001)，在采血前，所有研究相关细节均向参与者进行了解释，并获得了所有参与者的知情同意。在血样采集后，所有RVO患者都将接受正规的RVO治疗。

1.2 一般情况收集并记录所有受试者的基本信息，包括年龄、性别、体重指数(BMI)、糖尿病、高血压以及吸烟和饮酒史等。吸烟是指过去一年吸烟100支或以上，饮酒是指连续5个月每周至少饮酒一次。糖尿病和系统性高血压基于参与者的陈述，并通过血糖或血压检查进行确认。RVO组患者根据闭塞部位分为视网膜中央静脉阻塞(CRVO)组和视网膜分支静脉阻塞(BRVO)组，通过询问每个研究对象病史，详细记录病程。

1.3 眼科检查所有受试者都接受了全面的眼科检查，RVO的诊断是基于临床症状、裂隙灯检查、检眼镜检查以及眼底照相，由眼底病专家确认。初诊后至少随访1年，每2个月随访1次，行光学相干断层扫描(OCT)明确ME发病情况，视网膜厚度大于300 μm时诊断为ME。

1.4 实验室检测获得所有受试者的空腹外周血样本，分别采集含抗凝剂或不含抗凝剂的外周血各4 mL。将血液样本于室温下离心(1900 r·min-1，15 min)以制备血清和血浆，所有血清和血浆样本均于-80 ℃保存，以用于后续研究。

1.4.1 血糖及糖化血红蛋白测定通过葡萄糖氧化酶法并采用自动生化分析仪(Modular P800,Roche Diagnostics,瑞士)检测空腹血糖(FBG)。使用高效液相色谱法并采用自动化设备[Tosoh,HLC(r)-723HbG7，日本]测定糖化血红蛋白(HbA1c)。

1.4.2 炎症标志物检测采用免疫荧光检测仪(FS-112 Flying Test II，厦门)检测C反应蛋白(CRP)浓度。 CRP浓度超过5 mg·L-1者为升高。血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6等炎症标志物的血清水平均采用ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,美国)检测。实验操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 凝血功能测定利用自动凝血功能分析仪(SYSMEX,CA-1500，日本)对所有受试者血浆样本凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)进行检测，以评估凝血功能。

1.5 NETs相关标志物检测

1.5.1 中性粒细胞计数在获取参与者外周静脉血4 h内，将样本送至实验室，用五分类血细胞分析仪(BC-5300,迈瑞，中国)进行血常规检测，记录中性粒细胞数，以便进行进一步分析。

1.5.2 cfDNA定量分析使用PicoGreen双链DNA定量分析试剂盒(Invitrogen,美国)对血浆样本中的cfDNA进行定量。在室温下将PBS稀释后的血浆(110)和SytoxGreen荧光试剂(ThermoFisher Scientific,美国)混合在96孔板中，并使用读板器在485 nm/538 nm波长下获得光吸光度。根据标准曲线计算所有血浆样本的cfDNA浓度。

1.5.3 MPO-DNA复合物的测量参照Middleton等[9]的研究，使用固相修饰的针对MPO和dsDNA的特异性抗体进行MPO-DNA复合物的定量测量。将5 mg·L-1抗MPO单克隆抗体(Abcam,英国)包被的96孔板在4 ℃过夜。室温下，将96孔板用PBST(含体积分数0.05%吐温-20的PBS溶液)洗涤3次，然后用含40 g·L-1牛血清白蛋白(BSA;Sigma,美国)的PBST在室温下孵育2 h，以避免非特异性结合。接着，添加100 μL PBS稀释(110)的血清样品，室温下孵育2 h。PBST洗涤3次后，10 mg·L-1兔抗双链DNA多克隆抗体(Abcam,Cambridge,英国)室温下孵育4 h。PBST洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(Abcam,Cambridge,英国)室温下孵育1 h。PBS洗涤3次后，添加过氧化物酶底物(TMB；Bio-Rad，美国)，随后添加2N硫酸终止液。使用酶标仪(SpectraMax M5,美国)测量450 nm处的吸光度。

1.5.4 H3Cit的测量采用抗组蛋白抗体的ELISA试剂盒(Roche Diagnostics,瑞士)检测所有受试者血浆中H3Cit的浓度。5 mg·L-1H3Cit抗体包被的96孔板在4 ℃过夜，室温下PBST洗涤3次，加入含50 g·L-1BSA的PBST封闭缓冲液室温封闭1.5 h,再添加血浆样品室温孵育1.5 h。用封闭缓冲液冲洗3次后，添加15000的HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温下孵育1 h。添加TMB，然后用1 mol·L-1硫酸溶液在450 nm的波长下终止比色反应。使用酶标仪测量450 nm处的吸光度，并根据标准曲线计算所有血浆样本的H3Cit浓度。

1.6 统计分析连续性变量以均数±标准差表示，使用t检验分析两组之间的差异。分类变量用计数和百分比表示，不同组之间的差异用卡方检验进行分析。利用受试者工作特征曲线(ROC)分析NETs相关生物标志物对RVO的潜在诊断价值。用Pearson方法分析NETs相关标志物与炎症或凝血功能指标之间的相关性，线性相关性通过线性回归进行模拟。使用Graphpad Prism 8.3进行统计分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 临床特征和实验室检查RVO组患者与对照组受试者间的年龄、性别分布、高血压发生率、糖尿病发生率、吸烟史和饮酒史差异均无统计学意义(均为P>0.05)，RVO组患者的BMI、FBG和HbA1c均显著高于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。与对照组相比，RVO组患者PT、APTT均显著缩短，FIB、CRP、VEGF、IL-1β、IL-6等表达水平均显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表1)。

表1 两组受试者的临床特征和实验室检查结果

2.2 NETs相关标志物与RVO的相关性与对照组[(3.9±0.5)×109个·L-1]相比，RVO组患者外周血的中性粒细胞数[(4.5±0.8)×109个·L-1]增加(P<0.001)。对照组受试者外周血中cfDNA、MPO-DNA和H3Cit浓度分别为(7.9±0.6)g·L-1、(125.0±32.6)g·L-1、(3.4±1.2)g·L-1，RVO组患者分别为(21.0±29.8)g·L-1、(310.6±262.1)g·L-1、(15.6±31.2)g·L-1。与对照组相比，RVO组患者外周血中cfDNA、MPO-DNA和H3Cit浓度均有所增加(均为P<0.05)。进一步分析NETs相关标志物对RVO的诊断效果，结果显示，中性粒细胞数对RVO具有显著的诊断潜力(AUC=0.762，P<0.001)；cfDNA、MPO-DNA和H3Cit是RVO的潜在诊断标志物，AUC分别为0.859、0.871、0.928(均为P<0.001)。

2.3 NETs相关标志物与炎症/血栓状态的相关性Pearson相关矩阵分析结果显示，NETs相关标志物(cfDNA、MPO-DNA和H3Cit)与炎症因子(VEGF、IL-1β和IL-6)、血栓指数(PT、APTT、TT和FIB)均呈显著线性相关，可视化相关分析结果见图1。此外， cfDNA与 MPO-DNA、H3Cit以及MPO-DNA与H3Cit之间检测到显著的线性正相关，R2值分别为0.670、0.887、0.589(均为P<0.001)。

图1 NETs相关标志物与炎症指标和凝血功能指标之间的相关性 红色：正相关；蓝色：负相关。

2.4 CRVO与BRVO患者各指标差异与BRVO组患者相比，CRVO组患者病程较短，PT、TT较小，中性粒细胞数较高，VEGF、IL-1β、IL-6、cfDNA和MPO-DNA浓度均较高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，两组间其余指标相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表2)。

表2 CRVO组和BRVO组患者的临床特征、实验室数据和NETs相关标志物

2.5 NETs相关标志物与炎症和血栓的相关性为了检测NETs形成与炎症和血栓的关系，将RVO患者分成NETs相关标志物表达量前25%的RVO患者(较高组)和其余病例(较低组)进行进一步分析，相关数据见表3。在cfDNA较高组患者中，反映血栓形成状态的PT和TT较低(均为P<0.05)，CRP、VEGF、IL-1β和IL-6浓度较高(均为P<0.05)。与MPO-DNA较低组相比，MPO-DNA较高组患者的PT较低，CRP、VEGF和IL-1β浓度较高(均为P<0.05)。与H3Cit较低组相比，H3Cit较高组患者的FIB和IL-6浓度较高(均为P<0.05)。

表3 不同NETs严重状态下的炎症和血栓特征

2.6 NETs相关标志物与RVO病程及ME的关系将RVO组患者分为病程≤3 d组(急性期)和病程>3 d组(慢性期)两个亚组，对比后发现，两组患者cfDNA、MPO-DNA和H3Cit浓度差异均无统计学意义(均为P>0.05)(图2)。

图2 不同病程RVO患者的NETs相关标志物浓度 ns示差异无统计学意义。

随访1年，BRVO组及CRVO组患者中分别有25.7% (9/35)及21.4%(9/42)发生ME。对比后发现，CRVO组及BRVO组患者中ME与非ME患者的NETs相关标志物cfDNA、MPO-DNA和H3Cit的浓度差异均无统计学意义(均为P>0.05)(图3)。

图3 CRVO组及BRVO组中ME及非ME患者的NETs相关标志物浓度对比

3 讨论

RVO的发病涉及多种生物学过程，其具体分子机制尚不清楚。中性粒细胞是炎症反应过程中炎症因子的主要来源，然而，关于中性粒细胞在RVO中作用的相关报道较少。NETs是由活化的中性粒细胞释放的DNA网状复合体，具有多种生物学功能。除解聚的染色质DNA外，NETs结构主要由CitH3、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、MPO、PTX-3、抗菌肽以及30多种蛋白质和酶组成。由于NETosis与局部病理进展和系统性疾病进展均相关，因此，局部NETs形成和循环NETs相关标志物被用作不同疾病的生物标志物[10-12]。本研究结果表明，NETs相关标志物可能是RVO的潜在生物标志物，并且可能与RVO发病期间的炎症反应和血栓形成有关。本研究证明了NETosis与RVO风险之间的潜在关联，然而，在应用NETs作为RVO的诊断或治疗靶点之前，还有很多工作需要做。

RVO是一种视网膜血管疾病，也与全身性疾病有关。为了检测NETs在RVO发病中的作用，视网膜组织或玻璃体样本中的NETs将提供直接有力的证据。然而，获得RVO患者的视网膜组织几乎是不可能的，视网膜NETs标志物不适用于作为评价RVO的潜在指标。而RVO患者的玻璃体样本相对容易获得，尤其是在进行眼内注射操作时[13]。然而，眼内注射抗VEGF药物仅用于ME患者，这意味着只有晚期RVO患者才有机会提供玻璃体样本。因此，在本研究中，我们分析了RVO患者和对照组受试者外周血中循环NETs相关标志物的浓度。本研究结果表明，cfDNA、MPO-DNA和H3Cit这三种NETs相关标志物水平均与RVO发病相关。由于RVO患者的三种NETs相关标志物表达均增加，提示NETosis可能在RVO的发生发展中发挥重要作用。NETs作为RVO的生物标志物，为我们确定NETosis可能参与RVO的发生发展提供了重要线索。此外，NETs相关标志物未来可用于从整个人群中筛选RVO高危患者，但这仍需要更多的临床研究。

由于RVO是由视网膜静脉内循环微血栓和全身高凝状态引起的，这为我们探讨NETosis和血栓形成之间的关系提供了基础。我们研究团队先前的一项研究表明，凝血相关抗磷脂抗体含量与RVO风险增加有关[14]。考虑到血栓形成是一个复杂的过程，了解其在RVO发生发展中的作用，将有助于RVO的早期诊断和有效干预。据报道，NETosis与各种血栓相关疾病有关，并被视为潜在的治疗靶点[15]。越来越多的证据表明，NETs的促凝活性会促进多种凝血因子，刺激纤维蛋白沉积。考虑到NETs激活和血栓形成之间的相关性，NETs在各种血栓相关疾病中发挥了关键作用，包括中风、深静脉血栓、癌症或感染相关血栓[16-19]。在本研究中，严重的NETs状态与显著的血栓前活性相关，这些结果可能解释了NETs在RVO发生中的病理作用，至少部分如此。本研究存在的局限是我们的研究仅分析了四个凝血功能指标，其他凝血功能指标，例如D-二聚体、尿纤维蛋白原降解产物、凝血因子等在后续研究中应该纳入。

在本研究中，RVO组患者检测到较高的FBG和HbA1c水平，它们可能是NETs相关标志物与RVO发病率相关性的潜在混杂因素。首先，RVO组患者和对照组受试者之间的糖尿病发病率没有显著差异，入组的患者糖尿病病情均已得到控制，因此我们推测，RVO组患者中包括了较为严重的糖尿病患者。根据相关性分析，NETs相关标志物的浓度与炎症指标相关，包括CRP、VEGF、IL-1β和IL-6。由于上述炎症指标与RVO发病相关[20-21]，检测NETs在这些炎症因子中的作用将有助于我们更好地理解RVO发生发展的病理机制。近年来大量研究报道显示，NETs除了清除病原微生物外，还从多个方面参与炎性疾病的病理生理过程[22]。NETs可以增强自身免疫性疾病的炎症反应，包括牛皮癣、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮[23-24]。此外，据报道，自身免疫性疾病与NETosis有关。抑制NETs的形成可以降低许多疾病的严重程度，从而提高患者长期生存率[25]。在RVO的发展过程中，NETosis与炎症和凝血之间的复杂关系值得进一步研究。本研究经过1年随访，未发现ME及非ME患者中NETs标志物含量差异，NETosis与ME的复杂关系仍需要更大样本量及进一步的试验研究进行分析。

为了了解NETs与RVO风险之间的关系，本研究分析了不同亚型RVO(CRVO和BRVO)和不同病程RVO患者中NETs相关标志物的浓度。结果发现，与BRVO患者相比，CRVO患者中检测到更高的NETs相关标志物。这一现象很容易理解，因为CRVO通常与更严重的疾病状态、更严重的血栓形成以及更严重的炎症反应有关。此外，本研究还发现NETs相关标志物与RVO病程无关，急性期和慢性期均可检测到异常增加的NETs相关标志物。第一种解释是，异常NETs形成是一种常见的血管性风险相关标志物，因此，它与包括RVO在内的血管疾病有关；另一种解释是，本研究中使用的循环标志物反映全身状态，不直接指示局部疾病进展。这两种解释表明，外周血NETs相关标志物可能被用作RVO的早期诊断生物标志物。有趣的是，本研究发现，在RVO病程较长的情况下，所研究的三种NETs相关标志物(cfDNA、MPO-DNA和H3Cit)都略有减少，这为我们将这些因素作为RVO的预后标志物提供了可能性。

本研究为从NETs形成角度理解RVO发病提供了重要的临床依据。同时，本研究也存在局限性。首先，这是一项初步研究，仅检测到NETs相关标志物与RVO发病风险之间存在显著关联；其次，NETs的形成与多种病理过程有关，其在RVO发病中的具体作用有待进一步研究；再次，由于之前没有相关研究报道，因此很难估计所需的样本量，而相对较小的样本量将影响本研究的可信度。

综上所述，RVO患者血浆NETs相关标志物(包括cfDNA、MPO-DNA和H3Cit)显著增加，NETs的形成与炎症和血栓进展有关。未来需要进一步大样本的观察性研究和临床试验来确定NETs相关标志物在RVO发生发展中的诊断、预后和治疗潜力。