青蒿琥酯对大鼠实验性视网膜分支静脉阻塞的抑制作用△

陆秉文 胥 静 谢立科 杨 强

视网膜静脉阻塞(RVO)是继糖尿病视网膜病变后第二位常见视网膜血管病变，由于组织缺血、缺氧常引起黄斑水肿及视网膜新生血管病变，RVO是当前主要的致盲性眼病之一[1]。RVO发病机制尚不清楚，血管内皮生长因子(VEGF)在其中起着重要作用，玻璃体内注射抗VEGF药物是目前西医治疗RVO继发黄斑水肿的主要手段[2]。然而，抗VEGF药物治疗后黄斑水肿易反复发作，且价格昂贵，频繁注射不仅增加患者发生眼内炎、视网膜萎缩等的风险，更加重患者的经济负担。因此，寻找一种安全有效、价格低廉，更适用于临床治疗RVO的药物显得至关重要。

青蒿琥酯(Art)是青蒿素的衍生物之一，除抗疟作用外，还同时具有抗病毒、抗炎、免疫调节及抑制血管增生等作用[3]。前期有关研究报道，Art能够通过下调VEGF表达抑制兔虹膜和视网膜新生血管形成[4]。且研究发现，Art通过调控HIF-1α/VEGF信号通路抑制肿瘤血管新生[5]。然而，目前有关Art在RVO治疗方面的研究鲜有报道。我们前期针对RVO致病原因、RVO继发黄斑水肿发病机制、Art潜在作用靶点及Art治疗RVO继发黄斑水肿的效果进行了探讨[6]。本研究通过532 nm激光建立大鼠视网膜分支静脉阻塞(BRVO)模型，观察Art对BRVO的干预作用，以及对HIF-1α/VEGF信号通路的影响，进一步探讨Art治疗RVO的分子机制，以期为临床治疗RVO提供新思路和新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组取SPF级雌性Wistar大鼠(6～8周龄)150只，体重(200±20)g，眼前节、眼底检查无异常，大鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司。饲养条件：温度(22±1)℃，湿度60%～70%，光照12 h明暗交替。适应性饲养1周后，将动物随机分为6组，每组25只，右眼为实验眼：空白对照组、模型对照组(玻璃体内注射生理盐水)、康柏西普组(玻璃体内注射康柏西普)、Art高浓度组(玻璃体内注射50.0 mg·L-1Art)、Art中浓度组(玻璃体内注射25.0 mg·L-1Art)、Art低浓度组(玻璃体内注射12.5 mg·L-1Art)；空白对照组采用未造模大鼠进行实验，其他各组采用BRVO模型大鼠进行实验。本研究动物处理遵循《实验动物管理条例》(2017修订版)的规定。

1.1.2 主要试剂与仪器注射用Art(规格：60 mg；国药准字：H10930195)(桂林南药股份有限公司)，康柏西普眼用注射液(规格：10 g·L-1，0.2 mL/支；批号：202006b07)(成都康弘生物科技有限公司)，复方托吡卡胺滴眼液、氧氟沙星滴眼液及加替沙星眼用凝胶(沈阳兴齐眼药股份有限公司)，孟加拉红(北京百奥莱博科技有限公司)，SYBR Green荧光定量试剂盒(TaKaRa公司)，实验研究引物(大连万泽贸易有限公司)。Nd:YAG激光光凝仪(法国Quantel Medical公司)，Speotralis HRA+OCT激光眼科诊断仪(德国Heidelberg公司)，CFX-96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BRVO模型建立参照邹红等[7]采用光化学法建立大鼠BRVO模型：以复方托吡卡胺滴眼液滴大鼠右眼充分散瞳，称重后按照10 g·L-1水合氯醛溶液(3.5 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，以30 mg·kg-1尾静脉注射孟加拉红溶液(30 g·L-1)，行角膜表面麻醉及眼表涂加替沙星眼用凝胶后放置盖玻片，以532 nm激光封闭视网膜视盘颞上方相邻2支视网膜静脉(光斑直径50 μm，能量100 mW，曝光时间0.2 s)。每支静脉光凝25～30点，使被光凝封闭的静脉段长度约1视盘直径，被封闭静脉变细变白，血流停滞，远端迂曲扩张。之后行眼底照相及荧光素眼底血管造影检查，验证造模是否成功。

1.2.2 玻璃体内注射治疗造模成功后第3天给药。大鼠称重后腹腔注射麻醉，右眼以复方托吡卡胺滴眼液滴眼充分散瞳。行角膜表面麻醉后将大鼠置于手术显微镜下，左手持显微镊固定眼球，右手持微量注射器距角膜缘后1 mm处用30G注射针头垂直巩膜进针，进针后立即调整注射角度，避免划伤晶状体或损坏视网膜，缓慢推入3 μL药物或生理盐水，留针30 s后迅速拔出针头，立即用消毒棉签轻压注射点止血，局部涂抹加替沙星眼用凝胶。

1.2.3 视网膜组织病理学观察玻璃体内注药后1 d、3 d、7 d和14 d，过量麻醉处死大鼠后小心摘取眼球，分离视网膜组织，按染色要求处理后行石蜡包埋，4 μm连续切片。常规脱蜡后行HE染色，于200倍光镜下观察距视盘中心上方15 mm处视网膜组织的病理学改变并照相，采用LEICAQWIN图像分析软件于距视盘中心15 mm处双侧测量视网膜内层(包括内核层、内丛状层、神经节细胞层和神经纤维层)厚度，每只眼球取6张切片，结果取平均值。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测视网膜组织VEGF、HIF-1α mRNA表达玻璃体内注药后1 d、3 d、7 d和14 d，过量麻醉处死大鼠后小心摘取眼球，分离视网膜组织，Trizol法提取总RNA，测定浓度后，将总RNA逆转录为cDNA，并以此为模板进行后续实验。引物序列见表1。使用2-ΔΔCt计算各mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0统计学软件对所得数据进行统计学分析。数据符合正态分布且方差齐，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 玻璃体内注药后各组大鼠眼底照相检查结果玻璃体内注药后1 d，模型对照组，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠出现视网膜静脉阻塞、迂曲扩张及视网膜出血水肿表现。玻璃体内注药后7 d，康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜静脉再通，仅有小部分静脉血管阻塞；而康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜静脉阻塞表现差异不明显(图1和图2)。

图1 玻璃体内注药后1 d各组大鼠眼底照相检查 A：空白对照组；B：模型对照组；C：康柏西普组；D：Art高浓度组；E：Art中浓度组；F：Art低浓度组。红色三角示血管阻塞部位。

图2 玻璃体内注药后7 d各组大鼠眼底照相检查 A：空白对照组；B：模型对照组；C：康柏西普组；D：Art高浓度组；E：Art中浓度组；F：Art低浓度组。红色三角示血管阻塞部位。

2.2 玻璃体内注药后7 d各组大鼠视网膜组织HE染色结果玻璃体内注药后7 d，空白对照组大鼠视网膜组织结构完整、层次清晰，细胞排列整齐；模型对照组大鼠视网膜组织水肿，其中神经纤维层与内丛状层水肿明显，视网膜神经节细胞可见空泡样变性。康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜水肿基本消失，视网膜神经节细胞空泡变性明显改善(图3)。

图3 玻璃体内注药后7 d各组大鼠视网膜组织HE染色结果(×200) A：空白对照组；B：模型对照组；C：康柏西普组；D：Art高浓度组；E：Art中浓度组；F：Art低浓度组。

2.3 玻璃体内注药后不同时间各组大鼠视网膜内层厚度比较玻璃体内注药后不同时间各组大鼠视网膜内层厚度见表2。玻璃体内注药后3 d、7 d、14 d，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠视网膜内层厚度明显小于模型对照组(均为P<0.05)，康柏西普组与Art高、中、低浓度组间差异无统计学意义(均为P>0.05)。

表2 玻璃体内注药后不同时间各组大鼠视网膜内层厚度比较

2.4 玻璃体内注药后不同时间各组大鼠视网膜组织VEGF、HIF-1α mRNA相对表达量玻璃体内注药后1 d、3 d，模型对照组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较空白对照组均升高(均为P<0.05)；注药后7 d， HIF-1α mRNA相对表达量则降低(P<0.05)。注药后1 d、3 d，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较模型对照组均降低(均为P<0.05)。注药后7 d，Art中、低浓度组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较模型对照组则均升高(均为P<0.05)(表3)。

表3 玻璃体内注药后不同时间各组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量

玻璃体内注药后7 d、14 d，模型对照组大鼠视网膜组织VEGF mRNA相对表达量较空白对照组均升高(均为P<0.05)；康柏西普组，Art高、中、低浓度组VEGF mRNA相对表达量较模型对照组均降低(均为P<0.05)(表4)。

表4 玻璃体内注药后不同时间各组大鼠视网膜组织 VEGF mRNA相对表达量

3 讨论

视网膜血管阻塞病理机制复杂，其发病与高血压、糖尿病、动脉硬化等全身性疾病关系密切。尽管玻璃体内注射抗VEGF药物是目前治疗RVO继发黄斑水肿的有效方法，但抗VEGF治疗仍存在诸多局限性，患者易反复发作黄斑水肿，且抗VEGF药物价格昂贵，频繁注射不仅增加患者发生眼内炎、视网膜萎缩等风险，更加重患者的经济负担。

Art是青蒿素的衍生物之一，由于其半衰期长、水溶性好、副作用少等特点，近年来被广泛用于眼科临床。根据Art的药理特点，我们推测它能对RVO产生一定的治疗效果。Li等[8]利用玻璃体内注射80 μg Art治疗因角膜、虹膜和视网膜新生血管所致的无光感患者，发现注射 Art后患者眼部新生血管均较以前减少，视盘水肿减轻。我们前期亦总结了Art在眼科的应用前景及潜在作用机制，并针对RVO致病原因、RVO继发黄斑水肿发病机制、Art潜在作用靶点以及Art对RVO继发黄斑水肿的治疗作用进行了探讨[9]。

本次我们通过眼底照相观察发现，玻璃体内注药后1 d，模型对照组，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠均出现视网膜静脉阻塞、迂曲扩张及视网膜出血水肿表现。玻璃体内注药后7 d，康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜静脉再通，仅有小部分静脉血管阻塞；而康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜静脉阻塞表现差异不明显。HE染色结果显示：玻璃体内注药后7 d，空白对照组大鼠视网膜组织结构完整、层次清晰，细胞排列整齐；模型对照组大鼠视网膜组织水肿，其中神经纤维层与内丛状层水肿明显，视网膜神经节细胞可见空泡样变性。康柏西普组和Art高、中、低浓度组大鼠视网膜水肿基本消失，视网膜神经节细胞空泡变性明显改善。玻璃体内注药后3 d、7 d、14 d，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠视网膜内层厚度均明显小于模型对照组。这提示Art对实验性BRVO所致视网膜损伤具有一定保护作用。

本研究中玻璃体内注药后1 d、3 d，模型对照组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较空白对照组均升高；注药后7 d， HIF-1α mRNA相对表达量则降低。注药后1 d、3 d，康柏西普组，Art高、中、低浓度组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA相对表达量较模型对照组均降低。由此可见，Art能够通过降低造模后早期HIF-1α的表达以及造模后期VEGF的表达，从而减少大鼠实验性BRVO的视网膜损伤。

目前制作BRVO模型方法较多，如血管结扎法、透热法和光化学法等。由于光化学法只损伤视网膜血管内皮细胞，通过一系列级联反应导致血小板聚集形成血栓，与人类BRVO的静脉血栓成分及形成机制相近似，操作简便且对动物眼球损伤小[10]，因此，本研究采用此种造模方法。

综上所述，体内研究结果证实Art能够减轻BRVO大鼠视网膜损伤程度，其机制可能与调控HIF-1α/VEGF信号通路有关。Art作为中医药作用靶点多且毒副作用小，其在眼科疾病中有广阔的应用前景，它的潜在价值有待进一步研究证实。