基于分子影像学评价HMGB1因子在家兔胰腺癌发生发展机制中的应用研究

郝利国 荣 玮 李 峥 张春晶 崔红升

(齐齐哈尔医学院医学技术学院影像设备与技术学教研室 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目，项目名称：基于分子影像学评价HMGB1因子在家兔胰腺癌发生发展机制中的应用研究，项目编号：2018-KYYWF-0085

胰腺癌是一种恶性程度高，早期诊断困难的肿瘤，近年来其发病年龄呈现明显年轻化趋势。高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1, HMGB1)是与细胞损伤相关的一种分子[1-4]，是导致慢性炎症和修复性反应的重要原因。研究表明HMGB1与多种肿瘤信号相关[5]。HMGB1的过度表达可使获得肿瘤表型的细胞避免凋亡，从而导致肿瘤的发生。HMGB1在前列腺癌、结肠癌、肺癌以及食道癌等均高度表达[6-7]。以HMGB1为特异性靶点，研究其在胰腺癌进展中的作用，并阐明HMGB1是否通过影响细胞增殖/凋亡、血管生成、免疫调节等控制肿瘤进展，利用分子影像学评价胰腺癌细胞的HMGB1表达情况，分析HMGB1在肿瘤免疫中的调节作用，通过胰腺癌HMGB1分子功能成像[8]，评价HMGB1对胰腺癌肿瘤细胞增殖与凋亡、血管生成以及免疫微环境的影响，有望为胰腺癌的防治提供新思路。

1 资料与方法

1.1.1一般资料

由齐齐哈尔医学院动物中心提供家兔12只，成功制备模型兔 (胰腺癌) 12只，模型制备部分、MR分子成像、超声监测部分在齐齐哈尔医学院及附属三院进行。

1.1.2仪器

仪器型号激光粒度测定仪Nicomp380ZLS,美国PSS透射电子显微镜HT-7700,日本日立粒度分析仪NICOMP-380ZLS,美国PSS核磁共振造影剂弛豫率分析成像系统EDUMR20-015V,苏州纽迈电感耦合等离子体质谱-质谱仪ICP-MS,Agilent 770s,美国超纯水系统Millipore Synergy,美国密斯博小动物活体成像仪美国珀金埃尔默荧光倒置显微镜AXIO OBSERVER,德国多功能酶标仪Safire2,奥地利

1.2研究方法

1.2.1 实验方法

(1)本实验中采用VX-2组织悬液种植的12只家兔中成瘤率为100%，稳定性较高；但采用此法瘤块过大,且肿瘤组织在短期内难以快速建立有效血液循环,易发生液化,因此采用剂量1-5mm3的组织块进行植入，以上模型兔在动物实验中心标准饲养。

(2)MRI检测，利用3.0T MR行冠状位T2成像、轴位T2成像、弥散加权成像、波谱成像，分别在平扫和增强下获得12只荷瘤兔的图像。通过对图像中感兴趣区域(ROI)的分析，得到信噪比(SNR)并评估影像增强效果。

(3)超声检测：利用vivid 9对12只荷瘤兔超声检测，获得平扫、多普勒、弹性成像等超声数据，同时进行超声增强检查。

(4)探针的制备和偶联：选取HMGB1在胰腺的特异性靶点，制作HMGB1分子探针，行MRI检查扫描，获得分子影像图像。

研究表明，公路沥青路面基层施工过程出现硬化现象的原因为：材料配置比例不合理。这里的配置材料主要指：沥青与混凝土。如，材料配比的混凝土较多或是沥青较少的情况下，就会导致路面结构出现凹坑与塌陷现象。

1.2.2 探针合成部分

配制0.1 mM的HAuCl4溶液备用，取适量1 mg/mL的PVP溶液于茄形瓶中，将茄形瓶放于恒温磁力加热搅拌器内加热搅拌，温度达到90℃以后，缓慢滴加银纳米粒子溶液2mL，2min后，向茄形瓶内缓慢滴加氯金酸溶液0.2ml，待溶液变化为浅蓝色时，加热并搅拌约两分钟。取出茄形瓶冷却至室温，向瓶中加入足够的NaCl溶液产生AgCl，将溶液离心去除上清液，用1:1配置的乙醇与去离子水的混合液洗涤离心1次，再次去除上清后，加入去离子水2mL 使其充分分散。

取上述步骤制备的金纳米溶液20mL，向内加入稀盐酸，将pH值调至5.0，然后加入2mg GdCl3，混匀溶液后置于摇床上孵育1h。孵育结束后，室温下离心10min后去除上清液。取SH-PEG-NH30mg，用20 mL碳酸盐缓冲液(pH=8)进行溶解，使用超声波震荡仪器震荡10分钟，充分溶解PEG。然后重悬溶液，上述操作去上清后的沉淀，超声分散10min，并加入0.1%的SDS，孵育24h，加入50 μLEDC溶液和60 μLNHS溶液活化30min，随后加入PEG溶液中，并同时加入10uL的Cy5.5荧光分子溶液，避光置于摇床上孵育24h。去除上清液、未反应的核酸及荧光分子，用含有0.1% SDS的碳酸盐缓冲液重悬。

1.2.3 探针基本表征

(1)透射电子显微镜表征：使用超声波震荡仪器将稀释后的少量样品震荡分散均匀，然后用吸管滴加于非晶碳膜铜网上，将样品放于透射电子显微镜下对纳米颗粒进行表征。

(2)纳米探针的水动力尺寸及表面电荷情况：将稀释后的样品溶液置于粒度分析仪测定去离子水动力尺寸及其表面电荷性质，计算三次测量的平均值。

(3)体外MR成像：体外弛豫率测定及MR成像，室温下分别制备不同浓度的纳米探针溶液，进行3.0T磁共振扫描，观察T1成像情况，计算其r1值。

(4)病理采集及标本制作，影像检查后即刻处死家兔模型，连带肿瘤表面皮肤(用于定位)解剖取下肿瘤，纵切肿瘤，同时取下心、肝、脾、肺、肾等重要脏器。

(5)将家兔肿瘤组织切片使用Western blot法检测HMGB1的表达情况。

1.3统计学方法

本文采用SPSS20.0(美国芝加哥SPSS Inc.)分析处理软件对两组实验综合比较结果，对照样本分别进行多个对比分析数据处理,采用两组差异样本配对比较方法，采用t方法进行配对检验, 当P<0.05时为具有统计学意义。

2 结果

家兔在VX-2组织悬液种植后，摄食量、饮水量、毛色未见明显异常，体重由接种VX-2前的(2.12±0.34)kg降至(1.95±0.22)kg。MRI(图1，图2)及超声检查(图3)对肿瘤病灶的检出率均在90%以上，不过对于早期胰腺癌的检出率较低，注射HMGB1分子探针(图4，图5)后，所部获得的分子影像图像对于胰腺癌的检出率明显提升(图6)。病理结果显示，荷瘤兔体内的HMGB1的表达情况明显升高。

图1 肿瘤模型CT平扫

图2 肿瘤模型MRI DWI扫描

图3 肿瘤模型超声平扫

图4 探针不同梯度图像

图5 探针电镜TEM图像

图6 注入探针模型横断位MR图像

表1 荷瘤兔注射HMGB1分子探针前后的体重(单位：kg)

荷瘤兔处死后，分别取实验组和对照组的脏器(肺脏、肝脏、心脏、脾脏、肾脏)，对苏木精伊红(H&E)染色的器官切片进行组织学评价，未发现明显的急性病理改变。对荷瘤兔肿瘤组织切片使用Western blot法检测HMGB1的表达情况，结果显示，荷瘤兔肿瘤组织切片中的HMGB1相对于普通家兔含量明显升高，且注射探针后的肿瘤分子影像图像检出率与HMGB1的含量成线性相关有望在分子层面实现胰腺癌的早期诊断。

3 讨论

胰腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤，死亡率极高，研究发现HMGB的最终产物RAGE过度表达于胰腺癌细胞株MIAPaCa-2和PANC-1中，该癌株中HMGB1的表达高于癌旁组织，且蛋白表达量与与癌灶的大小及浸润深度呈现正相关趋势。

HMGB1是一种高度保守的非组蛋白的核蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有高迁移率而得名。它是一种进化上高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白，存在于所有有核细胞中[9]。HMGB1在溶细胞死亡过程中被被动释放，并由激活的先天免疫细胞分泌。某些翻译后修饰的HMGB1亚型在感染和无菌炎症条件下作为促炎介质在细胞外发挥作用。NF-KB是一种成熟的炎性转录因子，几乎所有动物的细胞都可以产生。且目前尚无相关分子影像评价HMGB1在胰腺癌发生发展机制中的研究报道。HMGB1在胰腺癌中的表达及临床意义也还不是十分明确，其在胰腺癌免疫调节中的作用也尚未确定]。高迁移率族蛋白B1-HMGB1在胰腺癌发生发展中可能具有重要作用

本研究利用磁共振和超声两种检查手段，评价家兔胰腺癌模型，分析计算得出图像的信噪比(SNR)、ADC值、对比噪声比(CNR)、对比度和病灶基本影像信息，通过与病理以及免疫组化、Western Blot之间的相关性分析，能够获得肿瘤微观病理变化及蛋白水平上的分子功能影像学表现，同时寻找HMGB1在胰腺中的特异性靶点，制作分子探针，利用MRI获得来源于胰腺的HMGB1的分子影像，并且评价HMGB1对胰腺癌肿瘤细胞增殖与凋亡、血管生成以及免疫微环境的影响，了解胰腺癌的发生发展阶段，实现胰腺癌的早期诊断，早期治疗。

本研究成功建立了HMGB1探针，该探针可显著提升胰腺癌的检出率，具有良好的生物安全性和稳定性，有望在分子层面实现胰腺癌的早期诊断。