鸭坦布苏病毒感染对occludin和claudin－1基因mRNA表达的影响

逯璐，苏兴海，马世宝，张琳

(1.山东管理学院新兴业态发展研究所，山东 济南 250357；2.招远市动物疫病预防控制中心，山东 招远 265400；3.德州市陵城区畜牧兽医服务中心，山东 德州 253599；4.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东 济南 250100)

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是引起蛋鸭产蛋率骤降、肉鸭和育成鸭死亡的主要病原之一，给养鸭业带来了巨大的经济损失[1，2]。以该病毒为病原的鸭坦布苏病毒病于2010年流行于我国东南沿海，近年来已成为水禽养殖业常见且频繁流行的疫病之一，也是必须监测和防控的疫病之一[3]。目前对于该病的预防主要依靠商品化疫苗，但疫病仍频繁出现，且呈地方性流行趋势，表明DTMUV已在不同区域定殖并在不同选择压力下突变产生地方流行株[4]。鉴于病毒突变的加速和相应疫苗研发的滞后，对DTMUV的感染与致病机制进行深入研究，从中挖掘更为有效的抗病毒策略成为该病毒的研究重点。

紧密连接(tight junctions，TJ)是一种膜内多蛋白复合体，广泛存在于上皮细胞和内皮细胞间，是封闭细胞间隙维持上皮屏障功能、调控细胞通透性控制内外物质进出的重要成分[5，6]。紧密连接蛋白主要由咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudins)、闭合小环蛋白(zonula occludens，ZOs)和连接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)组成，它们与细胞骨架蛋白将相邻细胞连接起来构成上皮屏障，以阻挡病原微生物的入侵，维持生理环境的稳定[7]。但TJ蛋白也能够被病毒“劫持”，成为感染细胞的“利器”。已有多篇报道显示，病毒能够使用TJ蛋白作为细胞受体感染靶细胞:occludin、claudin－1是丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)入 侵 细 胞 的 共 受体[8，9]，而claudin－6和claudin－9不仅是该病毒的共受体，而且能够介导病毒在细胞间的传播[10，11]。claudin－1是登革热病毒(Dengue virus，DENV)进入细胞的关键分子[12]；occludin是西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)突破血脑屏障引起神经症状的关键蛋白[13]。此外，claudin家族蛋白还是日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)[14]、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)[15，16]等病毒感染与扩散的重要分子。

DTMUV所在的黄病毒属病毒具有高度相似的结构组成，入侵细胞也采用类似的策略[17，18]，但功能性受体至今未能明确。HCV为黄病毒科丙肝病毒属病毒，其细胞受体已明确，而与DTMUV进化关系最为密切的DENV、WNV、JEV同为黄病毒属病毒，但功能性受体始终未能鉴定出来。occludin或claudin－1在上述病毒侵入细胞与扩散环节均起到了重要作用，但在DTMUV感染细胞过程中扮演怎样的角色尚不清楚。本试验利用DTMUV感染非洲绿猴肾(vero)细胞，采用荧光定量方法对occludin和claudin－1基因mRNA的表达量进行检测和比较，以有助于明确两蛋白分子在介导DTMUV入侵细胞中的作用，为后续功能受体的筛选、入侵机制以及抗病毒制剂的研究与开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

DTMUV(TCID50为10－6.5/0.1 mL)由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室分离鉴定并保存，非洲绿猴肾(vero)细胞由本实验室保存。微量总RNA(病毒/细胞)提取试剂盒购自北京百迈客生物科技有限公司。One Step TB Green PrimeScript PLUS RT－PCR Kit(Perfect Real Time)、TB GreenPremix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)荧光定量PCR试剂盒、M－MLV反转录酶购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组 试验开展时间为2021年6—12月。分别设置试验组和对照组，每组5瓶(25 cm2方瓶)细胞，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养。待24 h细胞长成单层后，试验组加入100TCID50的病毒液1 mL，置于细胞培养箱中孵育1 h，期间每30 min轻晃混匀一次，对照组以营养液替代病毒液进行相同操作。弃去细胞瓶中的液体，并用预冷的PBS轻轻洗2次，去除未吸附病毒。随后在每个细胞瓶中加入9 mL含2%血清的MEM培养基，继续进行培养，分别于12、24、48、72 h收集试验组和对照组细胞及其上清，进行病毒载量和紧密连接蛋白相关基因表达量的荧光定量检测。

1.2.2 荧光定量PCR引物的设计与合成 病毒载量的测定采用绝对荧光定量PCR方法，紧密连接蛋白相关基因表达量的检测使用相对定量的方式。基因扩增引物经oligo 6.0设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成 采用微量总RNA(病毒/细胞)提取试剂盒分别提取细胞与培养液上清总RNA，RNA样品经DNaseⅠ消化后，使用随机引物和M－MLV反转录酶进行cDNA链的合成。RNA与cDNA产物置于－80℃备用。

1.2.4 荧光定量PCR 测定DTMUV含量的绝对荧光定量PCR体系参照李海燕等[19]的方法。occludin、claudin－1和β－actin的引物首先进行特异性和有效性验证，表达量的检测反应总体系(20 μL):2×SYBRPremix Ex TaqⅡ10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，双蒸水补足20 μL。反应条件:95℃1 min；95℃15 s，63℃25 s，72℃30 s，共40个循环，每个循环收集荧光信号；95℃5 s，60℃1 min，进行溶解曲线分析。所有样品的检测均设置3个重复。为了证实扩增序列的准确性，将PCR产物纯化后连接pMD18－T，并进行测序。

1.3 数据分析

所有基因检测均重复3次，取平均值。病毒含量根据标准曲线计算获得，两紧密连接基因相对表达量用2－△△Ct法计算，β－actin为内参，结果以变化倍数进行表示。应用GraphPad Prism 5的student’st－test分析原始数据，并进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 occludin和claudin－1荧光定量引物的验证

利用反转录cDNA进行新设计荧光定量引物的验证。结果如图1所示，引物可以有效扩增目的基因，溶解曲线单一，表明引物的有效性和特异性良好，可以满足定量检测occludin、claudin－1和β－actinmRNA的要求。同时，回收扩增片段经测序和比对证实了片段的准确性。

图1 occludin(A)、claudin－1(B)和β－actin(C)荧光定量PCR的扩增及溶解曲线

2.2 vero细胞中的病毒含量

以100TCID50的DTMUV感染vero细胞，60 h左右细胞开始出现病变，而对照细胞正常。对感染后细胞上清中的病毒含量进行检测，发现病毒可在细胞中有效复制，并在48 h达到峰值，之后开始缓慢下降，而对照组始终未检测到病毒(图2)。

图2 细胞中的病毒含量

2.3 occludin基因的表达量

与对照组相比，occludin基因的表达量先上调后下调，12 h为表达峰值，而后逐渐降低，72 h仅为对照组的59%(图3)。

图3 occludin基因的表达量

2.4 claudin－1基因的表达量

与对照组相比，claudin－1基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势(图4)。在感染前期，claudin－1claudin－1的表达量上调，至24 h达到峰值，而后开始下降，至72 h表达量下调，为对照组的76%。

图4 claudin－1基因的表达量

3 讨论与结论

病毒侵入宿主细胞是整个复制周期的首要环节，而受体是介导病毒吸附、内吞以及膜融合等侵入过程的关键宿主因子[20，21]，它决定了易感宿主的范围、组织嗜性和致病性。所以，对受体的研究成为了解病毒入侵机制以及开发抗病毒制剂的突破口。

DTMUV具有较为广泛的宿主范围，除了感染鸭、鹅等水禽和鸡、麻雀等其他禽类外[22，23]，也可以感染哺乳动物[24]，亦有感染人类的报道，但并不表现出致病性[25]。病毒还具有广泛的组织嗜性，除肝脏、脾脏、心脏等多脏器会发生较为明显的病变外，还会出现严重的生殖系统病症和典型的神经症状[26，27]。在病毒的体外培养时，DTMUV在多种来源的细胞和禽胚均可增殖[28]。这些现象表明，DTMUV的细胞受体应该是多物种、多组织器官普遍存在且功能高度保守的蛋白分子。

前期通过细胞膜蛋白质组的测定，发现了多种在DTMUV感染后表达量发生明显变化的蛋白分子(结果另文发表)，occludin、claudin－1就是其中的两个。两者是紧密连接蛋白重要的组成部分，广泛分布于各组织中，但含量存在差异，在免疫细胞丰富的组织中含量较少，而在免疫细胞较少的组织中含量较高，体现了它们在组织防御功能中的补偿作用[6]。特别要指出的是，在正常情况下，紧密连接蛋白还是构成血脑屏障的重要组分[29]。DTMUV感染病例多有神经症状，病毒是如何突破血脑屏障的，一直未见报道。相关研究表明，在脑病发生时，occludin的表达量会发生显著变化，已成为诊断脑病的重要生物指标[29]。occludin是否也被DTMUV作为细胞受体利用或者起到利于传播的作用以突破血脑屏障，在后续研究中需要进行深入探讨。

DENV－2感染人真皮微血管内皮细胞后会激活整合素β3的上调表达，从而利于病毒的入胞[30]；感染的小肠上皮细胞和vero细胞中，随着PEDV的复制，occludinmRNA的表达量显著上调，两者的结合及内化是病毒进入细胞的关键[31]，类似的结果也出现在PRRSV与感染细胞(Mark145)的claudin－4相互作用中[32]。在本试验中，DTMUV感染后的12～48 h，病毒含量明显上升，而occludin和claudin－1也均为上调表达，表明病毒的感染激活了两个基因的表达，提示在病毒感染细胞的过程中可能以受体或关键因子的身份参与了病毒入侵细胞的过程。而随着病毒的进一步增殖，72 h细胞已出现明显病变，occludin和claudin－1mRNA的表达量变为下调表达，这应该与细胞发生损伤导致通透性改变以及随病毒内化的紧密连接蛋白被降解有关。至于两分子与病毒粒子的结合机制及其在感染中的作用也是我们下一步的研究重点。