温和灸足三里穴对自然衰老大鼠的肾脏保护作用及肾组织纤连蛋白、转化生长因子-β1表达的影响

赵舒羽 刘文博 吴焕淦, 崔云华 张纾研 殷之光 戚 莉 刘世敏 林亚莹 赵 琛 黄 艳,

(1 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海，200437；2 上海市针灸经络研究所，上海，200030；3 上海中医药大学，上海，201203)

随着年龄增长，人体器官的结构和功能都会发生相应的改变，器官衰老是各种老年疾病发生发展的生物学基础，肾脏是衰老相关组织损伤的典型靶器官[1]。研究发现，在没有高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等衰老相关疾病的衰老人群中，肾脏也会发生多种结构及功能变化，可以认为这些变化是单纯衰老所引起的肾脏改变[2]。

临床研究表明，艾灸具有良好的延缓衰老作用。足三里穴是重要的保健要穴，已有实验研究证实，艾灸足三里穴可增加超氧化物歧化酶等酶类抗氧化剂的含量，降低丙二醛等代谢产物的含量，具有良好的抗衰老作用[3-5]。课题组前期临床研究发现，艾灸足三里、肾俞、关元等穴可改善老年人衰老相关症状[6-7]。本研究基于自然衰老大鼠模型，率先对衰老典型器官-肾组织进行靶向研究，以经典的小鼠衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)作为肾脏衰老的生物学指标，通过观察温和灸足三里穴对自然衰老大鼠肾组织结构与功能的影响，并进一步观察大鼠肾组织纤连蛋白(Fibronectin，FN)表达及转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-beta l，TGF-β1)基因转录情况，研究温和灸足三里穴对肾脏衰老的保护效应及机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性清洁级SD大鼠(56周龄、36周龄)，采购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002]，本研究得到上海中医药大学实验动物福利与伦理委员会的批准，并在此批准下进行(伦理审批号：PZSHUTCM190524004)。动物实验观察室明暗各12 h，室内温度为20～22 ℃，相对湿度为50%～70%，自由摄食与饮水。实验动物适应性饲养1周。未发现不良反应，饮食和饮水均正常的动物方可用于实验。实验过程中对实验动物的操作均符合动物福利的基本原则、3R原则等相关要求。

1.2 试剂与仪器 戊巴比妥钠(Sigma公司，美国，货号：P3761)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，货号：10009218)；多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司，货号：80096618)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，货号：10023418)；中性树胶(国药集团化学试剂有限公司，货号：10004160)；十二水合磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司，货号：200040618)；磷酸二氢钠(国药集团化学试剂有限公司，货号：200407008)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司，货号：10019308)；盐酸(国药集团化学试剂有限公司，货号：80070560)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天公司，货号：C0602)；无毒环保苏木素-伊红染液(南京建成科技有限公司，货号：D006)；Masson染色试剂盒(博士德生物公司，货号：GP1032)；大鼠Albumin定量ELISA试剂盒(司鼎生物科技有限公司，货号：SDR005196T)；即用型SABC三步法试剂盒(博士德生物公司，货号：SA1054)；抗纤连蛋白抗体(Anti-Fibronectin antibody)(上海艾博抗有限公司，货号：ab23751)特制细艾条(南阳汉医艾绒厂，直径0.5 cm，长度12 cm)；光学显微镜及分析软件(OLYMPUS公司，日本，BX53)；台式高速离心机(Eppendorf公司，德国，5810R)。

1.3 分组与模型制备 56周龄SD大鼠常规喂养至80周龄，建立自然衰老大鼠模型。56周龄大鼠采用随机数字表法分为自然衰老组、艾灸足三里组，每组10只。另购36周龄对照组大鼠10只。自然衰老组大鼠饲养至80周龄，单纯抓取，不进行治疗。艾灸足三里组大鼠14月龄开始进行温和灸干预，穴位定位方法参考《实验针灸学》(余曙光等主编，上海科学技术出版社，2014年出版)中常用动物穴位定位及相关文献，采用直径0.5 cm特制细艾条，温和灸单侧“足三里”穴，依据大鼠皮肤受热程度调整高度，距离穴位皮肤2～4 cm，1次/d，20 min/次，左右两侧穴位交替进行，共干预6个月。

1.4 标本采集与处理 全部干预结束后，大鼠禁食24 h(不禁水)，放入大鼠代谢笼，编号收集尿液，离心(400×g，5 min)取得上清液，待检。2%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(0.2 mL/100 g)，剖开大鼠腹腔，干棉球钝性分离腹膜及肠道组织，腹主动脉取血，离心(1 200×g，10 min)取上清，-80 ℃保存；于冰浴环境取大鼠双侧肾组织，将两侧肾脏分别十字剖开，分为8等份，左侧迅速放入冻存管，-80 ℃保存；右侧置于4%多聚甲醛，待测。

1.5 观察指标

1.5.1 一般状况观察 大鼠的精神状态、皮毛状况、活动情况、体质量变化。

1.5.2 SA-β-gal表达检测 肾组织冰冻切片中加入适当体积的SA-β-gal染色固定液，以充分盖住组织为宜，室温固定15 min；用1×磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)浸泡洗涤肾组织3次，每次5 min；吸除PBS，组织切片上加入适当量的染色工作液；37 ℃孵育过夜；封片，4 ℃保存，光镜下观察并拍照。应用Image-pro-pius图像分析系统进行图像分析。每张切片随机选取3个视野检测积分光密度(Intergal Optical Density，IOD)取均值进行统计学分析。

1.5.3 组织病理学观察

1.5.3.1 苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)染色 采用HE染色法对大鼠肾组织进行病理学观察。石蜡切片脱蜡至水；浸于苏木精缸中90 s；流水冲洗10 min；浸于1%盐酸乙醇中分化3 s；流水冲洗5 min；浸于伊红缸中2 min，蒸馏水中泡去多余染色，中性树胶封片，光镜下观察并拍照。

1.5.3.2 Masson染色 采用Masson染色法对大鼠肾组织进行病理学观察。石蜡切片脱蜡至水；40 ℃温热水漂洗玻片2次，60 s/次，蒸馏水湿润玻片30 s；R1核染液染色30 s，倒掉，冲洗液冲洗30 s；R2浆染液染色30 s，倒掉，冲洗液冲洗30 s；R3分色液分色8 min，弃去分色液；R4复染液复染5 min，倒掉，无水乙醇冲洗干净；中性树胶封片，光镜下观察并拍照。

1.5.4 24 h尿蛋白含量检测 采用酶联免疫吸附试验法检测各组大鼠24 h尿蛋白含量。将大鼠尿液与标本稀释液作1∶100稀释，配制标准品液，用双蒸水1∶20稀释；每孔各添加100 μL标准品液，充分混匀反应板，37 ℃静置30 min，洗板；每孔加酶标抗体工作液100 μL，37 ℃静置30 min，洗板；每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应15 min；每孔加入100 μL终止液混匀，30 min内用酶标仪在450 nm处测吸光度。

1.5.5 肾组织FN表达检测 采用免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织FN表达，烤片，依次置于二甲苯、梯度乙醇、0.01 mol/LPBS、3%过氧化氢溶液，正常山羊血清封闭液，室温下孵育，添加一抗，4 ℃孵育过夜，加二抗，DAB显色液，浸于苏木精中复染、梯度乙醇、二甲苯、中性树胶封片，待镜下观察。应用Image-pro-pius图像分析系统进行图像分析。每张切片随机选取3个视野检测IOD，取均值进行统计学分析。

1.5.6 肾组织TGF-β1mRNA表达检测 肾组织研磨，裂解，检测总RNA浓度和纯度。引物设计参照Gene Bank数据库中各目的基因的序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0设计，由华大基因公司合成。见表1。ABI ViiA 7 Real Time PCR System进行Real-time Quantitative PCR图像和数据采集，基因表达倍数采用2-△△Ct进行数据分析。

表1 基因引物信息

2 结果

2.1 温和灸对自然衰老大鼠一般情况的影响 36周龄对照组大鼠活动敏捷，毛色洁白，反应灵敏，饮食饮水无异常。自然衰老组大鼠随着月龄的增长，活动欠灵活，毛发逐渐枯黄，精神不振，饮食饮水量减少。艾灸足三里组大鼠活动较灵活，毛发润泽，色泽微黄，精力尚可，饮食饮水无异常，日常活动均有不同程度改善。

2.2 各组大鼠肾组织SA-β-gal染色比较 镜下观察，大鼠肾组织各层内均可看到SA-β-gal阳性表达。36周龄对照组肾组织中阳性表达染色较淡，出现阴性或弱阳性反应；自然衰老组肾组织中蓝染面积较大，染色较深；艾灸足三里组肾组织中阳性表达较衰老组弱，蓝染面积小，染色普遍偏淡。与36周龄对照组比较，自然衰老组、艾灸足三里组肾组织中SA-β-gal阳性表达显著增加(P<0.05)；与自然衰老组比较，艾灸足三里组肾组织中SA-β-gal阳性表达显著降低(P<0.05)。结果提示：80周龄自然衰老大鼠出现明显的肾脏组织衰老，艾灸足三里穴可以改善肾脏衰老。见图1、表2。

表2 各组大鼠肾组织中SA-β-gal阳性表达

图1 各组大鼠肾组织SA-β-gal阳性表达(SA-β-gal染色，×200)

2.3 温和灸对自然衰老肾组织病理学的影响

2.3.1 各组大鼠肾组织HE染色 36周龄对照组肾小球呈圆形或椭圆形，外周规整，分布密集，壁层上皮分布均匀，肾小球囊腔狭小，肾小管管腔规整；自然衰老组肾小球明显膨大，可见积液，肾小球系膜细胞细胞密度增高，肾小球囊腔明显扩大，肾间质出现少量炎细胞浸润；艾灸足三里组肾小球轻度膨大，肾小球系膜细胞细胞密度轻度增高。见图2。

图2 大鼠肾脏组织病理学观察(HE染色，×200)

2.3.2 各组大鼠肾组织Masson染色 胶原纤维染色呈蓝色，36周龄对照组大鼠未见明显胶原阳性染色；自然衰老组肾间质中可见大量蓝色胶原纤维；艾灸足三里组仅见血管周围少许胶原组织。见图3。

图3 大鼠肾脏组织Masson染色(Masson染色，×200)

肾组织HE染色结果提示：自然衰老大鼠肾组织结构损伤，肾间质出现纤维化。艾灸足三里穴组能够减轻自然衰老大鼠肾组织病理学改变，改善肾纤维化状态。

2.4 温和灸对自然衰老大鼠24 h尿蛋白含量影响 与36周龄对照组比较，自然衰老组、艾灸足三里组24 h尿蛋白含量明显增加(P<0.05)；与自然衰老组比较，艾灸足三里组24 h尿蛋白含量明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠24 h尿蛋白含量比较[M(P25,P75)，mmol/L，n=10]

2.5 温和灸对自然衰老大鼠肾组织FN表达的影响 FN阳性表达染色呈棕黄色，在肾组织各层内均可看到FN表达。36周龄对照组肾组织中FN阳性表达主要分布在肾小球系膜内，染色较淡，呈阴性或弱阳性反应；自然衰老组肾组织中FN表达较36周龄对照组增多，呈阳性反应；艾灸足三里组肾组织中FN蛋白阳性呈弱阳性反应，表达较衰老组明显减弱。与36周龄对照组比较，自然衰老组、艾灸足三里组肾组织FN表达均显著增加(P<0.01)；与自然衰老组比较，艾灸足三里组肾组织FN表达显著降低(P<0.01)。见图4，表4。

图4 各组大鼠肾组织中FN表达(免疫组织化学染色，×200)

表4 各组大鼠肾组织中FN表达

2.6 温和灸对自然衰老大鼠肾组织中TGF-β1mRNA水平的影响 与36周龄对照组比较，自然衰老组、艾灸足三里组肾组织中TGF-β1mRNA表达明显增加(P<0.05)；与自然衰老组比较，艾灸足三里组肾组织中TGF-β1mRNA表达明显降低(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠肾组织中TGF-β1 mRNA表达[M(P25,P75)，n=10]

3 讨论

器官衰老是指个体生命进程中，因体内、体外因素引发的器官组成细胞的丢失和细胞外基质聚集，导致器官整体功能下降、对损伤因素易感性增强和应激反应能力的下降[8]。随着年龄的增长，肾脏的宏观和微观结构均会相应地发生变化。在微观结构水平上，肾脏的衰老主要表现在出现肾间质纤维化、肾小球硬化、基底膜增厚、肾小管萎缩和动脉硬化等病变[9]。本研究采用的自然衰老大鼠模型是抗衰老研究的理想动物模型，它能较精确且完整地反映机体衰老状态，符合人类衰老的特点。SA-β-gal是衰老研究的经典指标，表达SA-β-gal被认为是衰老细胞的特异性的标志。基于此模型，我们以经典的SA-β-gal作为肾脏衰老的生物学指标，观察36周龄(青年)大鼠和80周龄(老年)大鼠肾组织SA-β-gal的表达，镜下发现，在大鼠肾组织各层内均可看到SA-β-gal表达，36周龄对照组大鼠肾组织中阳性表达染色较淡，呈阴性或弱阳性反应；自然衰老组大鼠肾组织中蓝染面积较大，染色较深，提示80周龄组大鼠已经出现了明显的肾脏衰老表型。HE染色显示，36周龄对照组大鼠肾小球呈圆形或椭圆形，外周规整，分布密集，壁层上皮分布均匀，肾小球囊腔狭小，肾小管管腔规整；自然衰老组大鼠肾小球明显膨大，可见积液，肾小球系膜细胞细胞密度增高，肾小球囊腔明显扩大，肾间质出现少量炎症细胞浸润。Masson染色镜下观察结果显示，36周龄对照组大鼠肾组织未见明显胶原纤维增生改变；自然衰老组肾间质中可见大量蓝色胶原纤维。2组大鼠肾组织病理染色及纤维化染色表现符合肾脏衰老的病理改变及既往研究[10-11]。随着年龄增长，肾脏功能随之改变，肾脏衰老与肾损伤之间存在线性关系。本实验研究结果显示，与36周龄对照组比较，自然衰老组大鼠24 h尿蛋白水平升高，提示衰老大鼠发生增龄性肾功能减退和肾纤维化病理学改变。

肾纤维化是肾脏衰老过程中的重要病理变化，是导致增龄性肾功能减退的主要原因[12-13]。FN是一种重要的细胞外基质蛋白，具有结合纤维蛋白原和胶原的能力，在正常情况下呈现低表达，在病理状态下表达增多，其改变主要反映肾组织细胞外基质的变化。同时，FN是肾纤维化的效应因子，在纤维化的早期即可形成并广泛沉积，是反映肾纤维化的直观指标之一[14-15]。转化生长因子-β(TGF-β)，属于转化生长因子超家族的多功能细胞因子，包括3个不同的哺乳动物同工型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。TGF-β1在肾脏的表达最多，活性最强。已证实，TGF-β1是一种强效的致纤维化因子[16]，也是肾小管上皮-间充质转化的重要的诱导剂，在肾纤维化时表达增加，是目前抗纤维化治疗的主要靶标。本研究中，我们采用免疫组织化学法、实时定量PCR法分别检测肾组织中FN表达、TGF-β1mRNA表达，发现与青年对照组大鼠比较，自然衰老组大鼠的肾间质中可见大量蓝色胶原纤维，肾组织中FN表达增加，TGF-β1基因转录增强，TGF-β1mRNA表达增加。有报道，无论是原癌基因、应激诱导衰老以及复制性衰老的人成纤维细胞中都发现TGF-β1分泌增加[17-18]，衰老大鼠肾组织中也发现TGF-β1升高[19]。我们推测衰老过程中FN、TGF-β1分泌增多是衰老相关肾纤维化及肾功能减退的潜在原因。

艾灸疗法用于延缓衰老历史悠久，古今医家均证实了艾灸延缓衰老的有效性。《针灸真髓》曰：“三里养后天之气，灸三里可使元气不衰，故称长寿之灸。”有研究对温针灸关元、足三里穴延缓衰老的作用进行观察，结果显示，温针灸提高老年人血液的超氧化物歧化酶含量，具有明确的抗衰老作用[20]。廖运新等[21]为120例老年患者施灸，发现老年患者免疫功能得到明显加强，各衰老指标与灸前比较有显著性差异。大鼠的动物实验结果也支持了温和灸干预衰老的有效性[22]。本研究发现，温和灸足三里穴有效降低模型大鼠肾组织衰老标志物SA-β-gal的表达，改善肾脏衰老。我们进一步从肾组织结构和功能观察艾灸对肾脏衰老的影响，HE染色和Masson染色结果提示，温和灸足三里穴改善了自然衰老大鼠的肾小球结构，减轻肾组织炎症，明显抑制了肾间质纤维化。研究结果显示，温和灸足三里穴降低了衰老大鼠24 h尿蛋白含量，提示温和灸足三里穴改善大鼠增龄性肾损伤。免疫组织化学结果显示，温和灸足三里穴有效降低了衰老大鼠肾组织FN表达。实时定量PCR结果显示，温和灸足三里穴有效降低了衰老大鼠肾组织TGF-β1mRNA表达，提示抑制FN表达、TGF-β1基因转录可能是温和灸足三里穴发挥保护肾脏的作用机制之一。

中医学理论认为衰老是人体各项功能整体性下降的过程，这一过程可以理解为虚证，脏腑虚损是机体增龄性变化中的核心部分，不仅是衰老的特征表现，也是衰老的重要原因。五脏虚损日久则因虚致实，产生痰、瘀等病理产物，以致虚实夹杂，加速机体衰老。尽管各种老年慢性疾病的表现各异，但均以其器官衰老及功能减退作为疾病发生的生物学基础。因此，研究器官衰老及保护衰老器官功能是减少老年慢性疾病发生的前提条件。足三里穴是足阳明胃经之合穴，胃之下合穴，具有调理脾胃，补中益气的作用。《景岳全书》云：“胃为水谷之海，得后天之气也，人之始生，本乎精血之原，人之既生，由于水谷之养，非精血无以立形体之基，非水谷无以成形体之壮。”可见艾灸足三里穴是延缓衰老的重要手段之一。

本实验聚焦器官衰老角度探讨艾灸延缓衰老的可能机制，发现温和灸足三里穴能够改善自然衰老大鼠肾结构和减轻肾损伤，抑制肾组织FN表达、TGF-β1基因转录，延缓肾脏衰老，实验结果为艾灸延缓肾脏衰老的机制研究提供了初步证据。