燧心胶囊对心力衰竭大鼠心肌纤维化的保护作用

郭丹丹 于思明 李佳卓 许文婷 董柏涵

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)

心力衰竭(Heart Failure，HF)是心血管疾病的终末期表现和最主要的死因，几乎所有HF患者都有左心室迅速恶化的风险，但其具体机制尚不清楚[1]。研究表明，心肌纤维化参与了HF的进展，HF患者的左心室(Left Ventricular，LV)发现了心肌胶原纤维的显著积累[2]。因此，阐明心肌纤维化的机制，寻找抗心肌纤维化的药物对HF的治疗具有重要意义。燧心胶囊为黑龙江中医药大学国家级名老中医李延教授经验方，由真武汤与陈士铎“引火汤”化裁而来，具有提高LV射血分数，改善HF患者的临床症状的功效[3]。研究发现，心肌细胞凋亡在HF中发挥重要作用[4]。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase，AMPK)是细胞能量的感受器和代谢稳态的调节器，其激活对改善线粒体生物发生有重要作用[5]。此外，心脏AMPK活性降低被认为会增强心脏对果糖脂肪喂养大鼠缺血再灌注损伤的程度[6]。最近的研究表明，AMPK可以通过刺激核转录因子红系2相关因子(Nuclear Factor-erythroid 2-related Factor 2，Nrf2)依赖地血红素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)的上调来抑制氧化应激，并且在哺乳动物心肌能量代谢方面发挥着重要作用[7]。本研究建立了大鼠HF模型，探讨燧心胶囊对HF大鼠心肌纤维化的保护作用及其潜在信号机制，特别关注了AMPK/Nrf2信号，为燧心胶囊治疗HF提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠180～200只，体质量(200±20)g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(黑)2016-004，在黑龙江中医药大学实验动物中心按无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级操作规程适应性喂养1周后进行实验。本研究符合国家医学伦理相关规定。

1.1.2 药物 燧心胶囊由红参、制附子、熟地黄、麦冬、五味子、丹参、茯苓、白术、泽泻组成，为黑龙江中医药大学附属第二医院自制药，掉胶囊皮，用蒸馏水溶解后进行2次煎煮(30 min/次)，合并水煎液后进行浓缩，进行醇沉，将醇沉物用蒸馏水进行溶解，配成生药量为5.2 g/mL的溶液，分装灭菌，4 ℃冷藏备用；阿霉素(深圳万乐药业有限公司，国药准字H44024359)；缬沙坦胶囊(湖南千金湘江药业股份有限公司，国药准字H20103521)。

1.1.3 试剂与仪器 Masson染液(上海碧云天生物技术研究所，批号：954264)；活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：954612、631154、687912)；RIPA裂解缓冲液(上海生工生物工程有限公司，批号：20052342)；AMPK、Nrf2、HO-1、β-肌动蛋白和辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗鼠IgG(美国Santa Cruz公司，美国，货号：8457516、7538219、8124337、6434719)；VM7型便携式彩色多普勒超声诊断仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：VM7型)；ASP300S型组织脱水机和Leica RM2255型全自动轮转切片机等病理配套设备(Leica公司，德国，型号：ASP300S型和Leica RM2255型)；光学显微镜(Nikon公司，日本，型号：ECLIPSE MA200型)；HBS-1096B型酶标仪(南京德铁实验设备有限公司，型号：HBS-1096B型)；BIO-RAD垂直电泳仪(BIO-RAD公司，美国，Mini-Protean型)；凝胶成像仪(UVP公司，美国，型号：GelCam 310型)。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模 选60只成年雄性SD大鼠均分为对照组、模型组、燧心胶囊低剂量组、燧心胶囊中剂量组、燧心胶囊高剂量组和缬沙坦组。对照组大鼠腹腔注射生理盐水(2 mL/kg)，其余各组大鼠腹腔注射阿霉素溶液(2 mg/kg)，1次/周，连续6周，以多普勒超声显示左室射血分数(Left Ventricular Ejection fraction，LVEF)≤45%为HF模型成功标志[8]。

1.2.2 给药方法 造模成功后次日，燧心胶囊低、中、高剂量组依次灌胃给予燧心胶囊(1.3 mg/kg、2.6 mg/kg、5.2 mg/kg)[9]，缬沙坦组灌胃给予缬沙坦(13.35 mg/kg)[10]，1次/d，假手术组和模型对照组给予等量生理盐水，各组连续给药8周。

1.2.3 检测指标与方法 心功能检测：末次给药1 h后，对大鼠进行麻醉后平卧位固定，将探头置于胸骨左缘，取左室长轴最大直径处，标记室间隔与左室后壁收缩末和舒张末心内膜位置，采用VM7型便携式彩色多普勒超声诊断仪分别测量LVEF、左室缩短分数(Left Ventricular Fractional Shortening，LVFS)、左室收缩期末内径(Left Ventricular End-systolic Dimension，LVSD)、左室舒张末内径(Left Ventricular End-Diastolic Dimension，LVDD)，取5个心动周期求平均值。

大鼠心脏组织形态学检查：做完心功能检测后处死大鼠，分离心脏，沿左心室中部横轴切取0.5 cm厚的心肌组织，进行甲醛溶液固定，剩余心脏组织进行冻存。固定的组织经脱水，包埋、切片(4 μm)后进行Masson染色，用显微镜观察心脏纤维化变化。

心脏组织中ROS、GSH和SOD水平检测：称取100 mg心脏组织，用预冷生理盐水冲洗3次，按1 mL/100 mg的比例加入生理盐水，制成匀浆，离心半径10 cm离心10 min取上清，根据试剂盒说明书检测心脏组织中ROS、GSH和SOD水平。

蛋白质印迹法检测心脏组织中AMPK、Nrf2和HO-1水平：称取100 mg心脏组织，制成匀浆，加入1 mL RIPA裂解缓冲液，离心后取上清，进行电泳(30 μg/孔)、转膜，孵育AMPK(1∶200)、Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶400)和β-肌动蛋白(1∶1 000)抗体，过夜(4 ℃)，用IgG抗体(1∶10 000)在室温下孵育(30 min)，显色，采集图像进行分析。

2 结果

2.1 燧心胶囊对HF大鼠心功能的影响 与对照组比较，模型组大鼠LVEF和LVFS水平降低、LVSD和LVEDD水平升高(P<0.05)，模型组大鼠造模成功；与模型组比较，各燧心胶囊组和缬沙坦组大鼠LVEF和LVFS水平增高，LVSD和LVEDD水平降低，各燧心胶囊组大鼠LVEF、LVFS、LVSD和LVEDD水平随燧心胶囊剂量增加而变化，但缬沙坦组作用最显著(P<0.05)。见表1。

表1 燧心胶囊对HF大鼠心功能的影响

2.2 燧心胶囊对HF大鼠心肌纤维化的影响 在Masson染色中，心肌细胞染色为暗红色，胶原蛋白被染色为蓝色；对照组大鼠心肌细胞排列整齐、结构清晰；模型组组大鼠心肌细胞排列不规则、细胞肥大、细胞间出现大量的纤维组织；各燧心胶囊剂量组和缬沙坦组大鼠心肌细胞排列尚整齐，细胞轻度肥大，伴有不同程度的纤维组织增生，较模型组明显减轻，其中缬沙坦组大鼠改善最为显著。见图1。

图1 燧心胶囊对HF大鼠心肌纤维化的影响(Masson染色，×400)

2.3 燧心胶囊对HF大鼠心脏组织中ROS、GSH和SOD水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠ROS水平升高，GSH和SOD水平降低(P<0.05)；与模型组比较，各燧心胶囊组和缬沙坦组大鼠ROS水平降低，GSH和SOD水平升高，各燧心胶囊组大鼠ROS、GSH和SOD水平随燧心胶囊剂量增加而变化，但缬沙坦组作用最显著(P<0.05)。见表2。

表2 燧心胶囊对HF大鼠心脏组织中ROS、GSH和SOD水平的影响

2.4 燧心胶囊对HF大鼠心脏组织中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平降低(P<0.05)；与模型组比较，各燧心胶囊组和缬沙坦组大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平升高，各燧心胶囊组大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平随燧心胶囊剂量增加而变化，但缬沙坦组作用最显著(P<0.05)。见表3。

表3 燧心胶囊对HF大鼠心脏组织中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影响

图2 燧心胶囊对HF大鼠心脏组织中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影响

3 讨论

现代中医认为HF的病机主要是本虚标实，其中本虚以心气虚、心肾阳虚为主。温阳法是HF的常用治法，中医学的“引火归元”理论具有较重要的指导意义，引火归元在温振心阳的同时，增强了肾脏对上炎之火的收纳，使君火相火上下相济，从而达到温阳而不碍邪的理想状态[11]。燧心胶囊以温肾助阳、引火归元、化气行水为治则。方中以制附子为君，既补心火，又助肾阳；红参大补元气，复脉固脱，益气安神；熟地黄补肾水，麦冬滋肺阴，金水相生，水火既济，各安本位。再以茯苓、白术、泽泻导水趋下，使“妄火”随之下行，归于肾水；又佐以丹参活血养血，化瘀通络，祛除痰浊、瘀血等病理产物，且能调畅气机，从而达到“阴平阳秘”的平衡状态[12]。本研究结果显示，燧心胶囊能改善HF大鼠心功能，证实了上述中医理论。纤维化可能在舒张功能障碍和收缩泵功能方面发挥重要作用，是致死性心律失常的结构基质之一，从而在HF的进展和猝死中发挥重要作用[13]。研究证明，心肌纤维化的减少与高血压患者接受不同抗高血压药物(如缬沙坦)长期治疗时左室功能参数的改善有关[14]。本研究结果显示，缬沙坦能抑制减少HF大鼠心肌纤维化的产生，燧心胶囊也有类似作用，虽然其作用不如缬沙坦，但缬沙坦只能维持HF的稳态。因此，研究燧心胶囊治疗HF具有重要意义。

HF可导致心肌组织氧化应激和能量代谢紊乱，诱导线粒体功能障碍，增加ROS的产生，进而导致心肌氧化应激损伤，凋亡或坏死[15]。ROS的生理浓度对于维持基础细胞的活动至关重要，但过量产生的ROS可导致氧化应激的诱导。阿霉素会导致氧化应激和心脏结构改变，最终导致心肌损害。阿霉素增加了心脏组织对ROS的敏感性，同时降低抗氧化剂如谷胱甘肽过氧化物酶、GSH和SOD活性[16]。具有抗氧化活性的各种天然产物已被证明可恢复HF大鼠中这些抗氧化剂的功能。燧心胶囊的配方中有多种物质具有抗氧化活性，在心肌梗死引起的心肌损伤过程中发挥心脏保护作用，降低丙二醛含量和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的表达，并增强SOD活性，从而抵抗氧化应激[17]。本研究结果显示，燧心胶囊组能降低HF大鼠心脏中ROS水平，同时增加GSH和SOD水平，发挥一定的抗氧化活性。此外，燧心胶囊通过激活AMPK/Nrf2通路，发挥抗纤维化作用。然而，目前尚无直接的研究表明心肌系统中AMPK/Nrf2通路参与HF大鼠心肌纤维化调控，这正是本研究的创新性。

AMPK/Nrf2通路是一条公认的氧化应激途径。AMPK刺激上调了线粒体的生物发生，增加ATP生成，从而调节细胞能量含量，这对于抑制阿霉素引发的氧化应激是必要的。AMPK抑制加重了压力超载诱导的阿霉素喂养大鼠左心室肥厚[18]。在果糖饮食诱导的2型糖尿病中，氧化应激会触发AMPK磷酸化，从而刺激Nrf2及其下游抗氧化酶(包括HO-1)，给予AMPK抑制剂可抑制AMPK磷酸化，而且可以降低糖尿病心肌中Nrf2和HO-1的表达[19]。此外，AMPK刺激通过调节线粒体贮存和Nrf2通路，对产前应激诱发的认知缺陷的神经保护作用[20]。Nrf2也被认为与炎症小体的刺激有关，通过诱导线粒体生物发生，Nrf2的激活保护心肌细胞免受阿霉素诱导的心肌病[21]。同时，Nrf2会激活HO-1信号来保持复合体Ⅰ，复合体Ⅳ活性和线粒体膜电位，从而减少脑缺血再灌注引起的线粒体氧化损伤[22]。此外，Nrf2还通过抑制炎症介质的转录来阻断炎症反应，核苷酸结合寡聚化结构域样受体3炎症小体的激活需要通过抑制Nrf2表达，本研究将在后续的研究中进行完善[23]。

综上所述，燧心胶囊可通过降低心脏氧化应激水平及激活AMPK/Nrf2通路，抑制HF大鼠心肌纤维化，为燧心胶囊治疗HF纤维化提供了理论依据。