基于网络药理学研究逍遥散治疗经前期综合征的作用机制

曹一鸣 刘雁峰 王悦竹 史亚婷 宫玮珩

(北京中医药大学东直门医院，北京，100020)

经前期综合征(Premenstrual Syndrome，PMS)是情志病研究领域的代表性病种，当今医学界最为关注的问题。是指经前2周开始出现涉及身体(水肿、盆腔沉重坠胀感、头晕、头痛、乳胀)、情绪(烦躁易怒、悲伤欲哭、焦虑抑郁)和行为障碍(失眠、思想不集中)等多系统症状，一般在经前3～5 d最明显，对生活和工作均会带来一定的影响。患者常随月经周期性出现相应症状，经期症状逐渐减轻后消失。青壮年发病率高，其中较严重者或可合并不孕[1]。其发病机制尚不明确，目前普遍接受的有社会和心理、卵巢激素、遗传、中枢神经递质和自主神经系统学说[2]。

目前现代医学对PMS缺乏规范化的治疗方法，主要是对症治疗、调控精神症状、抑制排卵治疗等，虽大多能较快缓解症状，但也存在着一些局限性，如抑制排卵治疗对身体危害较大、不良反应多；抗抑郁焦虑类药物治疗远期疗效不理想[3]。而中医药治疗强调辨证论治，整体调节，在临床上得到广泛应用。

中医认为PMS的症状较为复杂多样，个体差异较大，与多个脏腑相关，其中与肝的关系最为密切，其证型最常见的则是肝失疏泄及肝气郁滞。大部分医家将PMS的病因责之于情志因素。本病的发生于肝、脾、肾三脏关系密切，其中又以肝最为密切[4]。王晓娟等[5]认为经前期脏腑功能失调导致了此类证候的发生，其中肝郁气滞最为主要。对PMS中医证型分布的临床流行病学调查研究也提示其与肝的密切关系，郑宸君[6]通过对502例PMS患者的流行病学调查发现其中医证型主要为肝气逆证、肝郁气滞证、阴虚肝旺证、肝气乘脾证、肝火上炎证。

逍遥散出自《太平惠民和剂局方》，具有疏肝养脾，养血调经之效，是治疗PMS最为广泛应用的方剂之一。方中柴胡疏肝解郁，为君药；当归养血调经，白芍柔肝养血，共为臣药；白术、茯苓健脾祛湿，甘草和中健脾，共为佐药；薄荷透肝经郁热，生姜温胃和中，共为使药。临床随机对照试验研究也验证了逍遥散加减治疗PMS的疗效[7-11]，其临床总有效率为83.30%～98.00%。

因此，运用网络药理学的方法研究逍遥散治疗PMS分子水平上的作用机制，可为应用逍遥散治疗PMS提供理论支持[12]。

本研究应用网络药理学方法，探讨逍遥散治疗PMS的分子作用机制，以求为该法的临床应用带来更强的理论依据和新的思路。

1 资料与方法

1.1 逍遥散有效成分及潜在靶点获取 应用中药分子作用机制的生物信息学分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM)和中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology and Analysis Platform，TCMSP)检索并获得逍遥散中所有活性成分数据，按口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18为条件筛选出有效活性成分。以此筛选出具有较高活性的化学成分，构建逍遥散的化学成分数据库。合并2个平台数据库的成分预测靶点，从而得到逍遥散八味中药有效化学成分-潜在靶点的数据集。

1.2 PMS靶点的获取 在GeneCards和在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)检索疾病名称“premenstrual syndrome”，从而得到PMS的相关靶点。

1.3 药物活性成分-疾病靶点网络图 通过构建逍遥散-PMS靶标韦恩图，得到药物和疾病的共同靶点，并获取映射信息。再用Cytoscape 3.7.2绘制网络图，用“节点”表示逍遥散，药物活性成分、PMS和作用靶点，“边”则表示节点与节点之间的关系。

1.4 药物-疾病核心蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络构建 登录STRING平台，“物种”选择“人”，导入得到的靶点交集数据集，从而构建逍遥散治疗PMS的PPI网络。打开Cytoscape 3.7.2软件，导入所得STRING数据库文件，选择“Network Analyze”，设定筛选标准：Degree值大于平均值，进行网络拓扑分析并筛选出核心靶点。节点代表蛋白质，边代表蛋白质与蛋白质之间的作用关系，网络连接程度越高说明蛋白质之间关系越密切。将网络图以TSV格式导入Cytoscape，以“Degree≥5”为标准筛选核心蛋白基因。

1.5 基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 打开DAVID平台，导入筛选后的PPI网络核心靶标，分别在网页中选择并获取生物过程(Biological Process,BP),细胞组分(Cellular Component,CC),分子功能(Molecular Function,MF)以及KEGG通路分析。设定筛选标准为“P≤0.05”，从而筛选出符合条件KEGG通路及GO富集结果，分别以气泡图、表格的形式展示。

2 结果

2.1 逍遥散有效化学成分收集及潜在靶点预测 检索TCMSP和BATMAN-TCM平台数据库得到逍遥散八味中药的活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、山柰酚、柚苷配基、谷固醇等，最终得到162种潜在核心化合物，预测出化合物对应靶点2 618个。

2.2 逍遥散治疗PMS潜在作用靶点 共得到逍遥散治疗PMS潜在作用靶点768个。

2.3 药物活性成分-疾病靶点网络图 获取逍遥散和PMS共同靶点21个。见图1。图2矩形表示方剂逍遥散，八边形表示PMS，三角形表示疾病和有效成分的共同潜在作用靶点(以基因表示)，椭圆形代表有效化学成分；共有节点36个，其中逍遥散、PMS各1个，有效成分105个，逍遥散治疗PMS潜在靶点21个。拓扑结构分析发现，节点的自由度前5位的有效成分为槲皮素(23)、豆甾醇(13)、山柰酚(13)、柚苷配基(11)、谷固醇(10)，这些成分与疾病的关系较大。

图1 逍遥散-PMS潜在靶点韦恩图

图2 逍遥散成分-PMS-靶点调控网络

2.4 药物-疾病的核心靶点PPI网络图 PPI网络图3共有21个节点，48条边，平均节点度4.57。筛选后共得到10个核心靶点的网络，核心靶点包括IKBKB、IL-6、IGFBP3、PGR、IGF2、PLAU、HIF1A、VEGFA、ESR1、CASP8。见图4。

图3 逍遥散治疗PMS潜在靶标相互作用网络

图4 逍遥散治疗PMS核心靶标相互作用网络

2.5 GO功能富集结果分析 GO生物过程分析得到分子功能、生物过程和细胞组分条目共92个。最终筛选出分子功能19条、生物过程43条和细胞组分6条。将19条分子功能、6条细胞组分，和所得的43个生物过程条目按P值从小到大的顺序排序取前20个条目，以气泡图的形式分别展示(图5～7)。其中分子功能包括Steroid binding(类固醇结合)、Enzyme binding(酶结合)、Steroid hormone receptor activity(类固醇激素受体活性)、Protein binding(蛋白质结合)等；生物过程包括Signal transduction(信号转导)、Transcription initiation from RNA polymerase Ⅱ promoter(RNA聚合酶Ⅱ的转录起始)、Negative regulation of IκB kinase/NF-κB signaling(IκB激酶/核因子κB信号的负调控)、Negative regulation of apoptotic process(凋亡过程的负调控)等；细胞组分包括Extracellular space(细胞外空间)、Extracellular region(细胞外区域)、Cytoplasm(细胞质)等。

图5 逍遥散治疗PMS的分子功能分析

图6 逍遥散治疗PMS的生物过程分析

图7 逍遥散治疗PMS的细胞组分分析

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析得到21条KEGG通路，最终筛选出信号通路17条。见表1。包括NOD样受体信号通路、癌症通路、癌症中的蛋白多糖、查加斯病(美国锥虫病)、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等，逍遥散治疗PMS可能通过以上通路产生疗效。

表1 KEGG富集分析

3 讨论

中医古典医籍中并不曾记载过PMS这一病名，但将其不同的症状分别论述于“月经前后诸证”中。PMS是一种以情感、行为和身体障碍为特征的综合征，随月经周期反复出现，其症状常于黄体后期出现，月经期逐渐减轻至消失[13]。中医认为“女子以肝为先天”，PMS的发生与肝的关系最为密切，乔明琦等[14]的流行病学调查显示PMS中肝气逆、肝气郁二证分别占58.9%和27.5%。大部分医家均认为从肝论治PMS可取得较好疗效。

本文运用网络药理学的方法，系统分析经典方剂逍遥散治疗PMS的机制。首先把检索获取到的逍遥散有效成分和PMS潜在靶点信息取交集，从而描绘“药物-成分-疾病”PPI网络图。进一步通过GO和KEGG的富集分析，得到药物潜在重要靶点干预的疾病通路和基本生物学通路，以期揭示逍遥散治疗PMS的分子层次原理，从而对中医临床应用，辨证用药提供强有力的依据。

3.1 活性成分 通过检索TCMSP和BATMAN-TCM平台数据库得到逍遥散八味中药的活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、山柰酚、柚苷配基、谷固醇等，这些活性成分可能与治疗PMS有关。

Yarjanli等[15]发现槲皮素药理作用广泛，包括抗炎、抗焦虑和认知增强等。王佳等[16]发现山柰酚对大鼠具有显著抗抑郁作用,其原理可能通过提高前额叶皮质部位去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine,DA)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)递质水平达到抗抑郁作用。Tayyab等[17]发现柚苷配基除了抗抑郁作用外，还可抑制抑郁大鼠行为异常，缓解认知障碍，缓解海马CA1区和皮质的形态异常。另外槲皮素和山柰酚均属于异黄酮类，其结构类似己烯雌酚以及雌二醇，是一种弱雌激素样物质,在体内起雌性激素样和抗雌性激素样的双重调节作用[18]，或可通过对雌激素的调节，降低醛固酮血管紧张素Ⅱ，改善水钠潴留导致的水肿、体质量增加等症状[19]。由此可见，逍遥散中诸多活性成分具有明确的抗抑郁、抗焦虑、对雌激素的双向调节作用，提示逍遥散对PMS情感、行为、躯体障碍均有潜在的治疗作用。

3.2 靶点 通过“药物-疾病”网络图可以发现雌激素受体(Estrogen Receptor，ESR)1、ESR2、孕酮受体(Progesterone Receptor,PGR)、毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3(Muscarinic Acetylcholine ReceptorM3，CHRM3)、盐皮质激素受体基因(Mineralocorticoid Receptor Gene,NR3C2)、谷胱甘肽转移酶(Glutathione Transferase P1,GSTP1)、胱天蛋白酶8(CASP8)等是药物治疗疾病的关键靶点。

研究发现,采用促性腺激素释放激素激动剂抑制卵巢功能使PMS症状得到控制后,加用外源性雌、孕激素反相添加，PMS症状有不同程度的重现，可见黄体后期雌、孕激素的异常对PMS的发生有一定程度的作用[20-21]。李学智[22]研究发现PMS猕猴和大鼠下丘脑ESR1和ESR2mRNA的表达水平、ESR2蛋白都有不同程度的下调；孕酮受体(Progesterone Rceptor,PGR)mRNA有所上调。于艳红等[23]研究发现PMS猕猴边缘系统中，ESR1和ESR2 mRNA表达降低，PGR mRNA表达升高。提示逍遥散可能通过激素调节的方式治疗PMS。核受体亚家族3组C分子2(Nuclear Receptor Subfamily 3,Group C,Member 2,Nr3c2，一种盐皮质激素受体)是公认的焦虑抑郁相关基因[24]，张利蕊[25]研究发现NR3C2中多个位点可能与暴力攻击行为有关联。Lombardi等[26]研究发现PMS患者肾上腺皮质对促肾上腺皮质激素的释放反应高于非PMS患者。Cornelisse等[27]发现，NR3C2有决定下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal Axis，HPA)活化阈值的作用。提示逍遥散可能通过调节HPA的方式治疗PMS。

3.3 富集结果分析 GO功能富集结果显示分子功能包括类固醇结合、酶结合、类固醇激素受体活性、蛋白质结合等，涉及的生物过程包括信号转导、凋亡过程的负调控、IκB激酶/核因子κB信号的负调控、RNA聚合酶Ⅱ的转录起始等。KEGG通路分析显示逍遥散活性成分及靶点通过以上表格中多通路作用于PMS。

目前，人体内共发现10种Toll样受体(Toll-like Receptor，TLR)TLR1～TLR10[28]，其中TLR4与抑郁的发生关系最为密切[29],在神经元的形成、5-HT生成、HPA的平衡、抗抑郁药物恢复神经功能等过程中都扮演重要角色[30]。Pandey等[31]通过对死亡抑郁症患者的尸检发现，其中背外侧前额叶皮质TLR3和TLR4的mRNA水平增加。激活的TLR4可激活β干扰素Toll/白细胞介素1受体结构域衔接蛋白信号转导通路，最终活化下游核因子κB信号通路，核因子κB进入核内调节炎症介质的基因表达和转录，进而引起各种神经病理改变[32-33]。长期服用PMS的一线药物氟西汀能够明显地降低TLR4基因的表达[34]。提示逍遥散可能通过抗抑郁，调节神经递质来治疗PMS。

综上所述，应用网络药理学的方法，系统分析并总结了逍遥散中主要有效成分、潜在的作用靶点及通路，揭示了逍遥散治疗PMS分子机制。但仍有一定的局限性，如能进一步通过实验验证本文中所述靶点通路的有效性，则能为临床提供更加有力的依据。