基于Wnt/β-连环素通路探讨补骨脂素对骨质疏松症大鼠的影响

王 健 张 驰

(辽宁中医药大学附属医院骨伤科，沈阳，110032)

骨质疏松症(Osteoporosis，OS)是一种全身骨代谢障碍性疾病，以骨量减少、骨微细结构破坏、骨脆性增加等为主要的病理改变[1]，容易引发骨折而致残、致死，给患者造成很大痛苦。OS主要分为绝经后、继发性以及特发性3种，其中以绝经后OS最为常见。该病好发于50岁以上人群，据统计，全球骨质疏松患者约2亿，美国绝经后女性中30%左右患OS[2]，我国作为老年人口最多的国家，OS患病率不断上升，50岁以上女性患病率已经高达20.7%，而这些患者中50%有可能出现骨折[3]。雌孕激素、选择性雌激素受体调节剂、双磷酸盐等骨吸收抑制剂，以及氟制剂、甲状旁腺激素等骨形成促进剂，以及骨化三醇、钙剂等骨矿化药物是临床上治疗OS的主要药物[4]，但长期使用不良反应明显。因此，国内医学界将新药研究的重点放在了安全性相对较高的中药制剂。补骨脂是治疗OS的常用补益中药，具有较好的抗骨质疏松作用[5]，但究竟该药何种成分如何发挥作用目前尚未明确。本研究从对Wnt/β-连环素(β-Catenin)信号通路的影响出发，探讨补骨脂主要活性成分补骨脂素对去势大鼠OS的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取12周龄无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级健康雌性SD大鼠78只，体质量240～280 g，平均体质量(262.64±10.93)g，购自中国医学科学院医学生物学研究所，动物许可证号：SCXK(滇)K2014-0002。该研究经辽宁中医药大学动物实验伦理委员会批准(伦理审批号：20170311)。将大鼠分笼饲养，每笼4只，饲养室内安静，温度设定为19～23 ℃，相对湿度设定为45%～55%，定时通风换气，昼夜节律为12 h/12 h，饲以普通标准饲料和无菌过滤水，大鼠在笼内自由活动，每周更换垫料2～3次并严格消毒。

1.1.2 药物 补骨脂素(安徽永纯生物技术有限公司，货号：YC-0139)，CAS号：66-97-7，纯度：用高效液相色谱检测含量≥98%，规格：10 mg/支，使用时用二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)溶解，双蒸水稀释配制成浓度为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL的补骨脂素溶液，现用现配；阿仑膦酸钠片杭州默沙东制药有限公司，批号：20170321)，规格：10 mg/片，使用时研碎成末，用DMSO溶解，双蒸水稀释配制成浓度为0.2 mg/mL的阿仑膦酸钠溶液，现用现配；注射用青霉素钠(桂林南药股份有限公司，批号：20170402)，规格：每支80万单位。

1.1.3 试剂与仪器 DMSO(北京凯瑞基生物科技有限公司，批号：201700526)；戊巴比妥钠(湖北鸿运隆生物科技有限公司，批号：20170418)；大鼠护骨因子(Osteoprotegerin，OPG)、骨钙蛋白(Osteocalcin，BGP)酶联免疫吸附试验试剂盒(无锡市东林科技发展有限责任公司，批号：20170602/20170722)；OPG、BGP免疫组化试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司，批号：20170704/20170629)；二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：20170421)；总RNA抽提试剂盒(Trizol法)(上海康朗生物科技有限公司，批号：20170317)；cDNA第一链合成试剂盒(深圳子科生物科技有限公司，批号：20170519)；低密度脂蛋白受体相关蛋白6(Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 6，Lrp6)、糖原合酶激酶-3β(Glycogen Synthase Kinase-3,GSK-3β)、β-连环素(β-catenin)、Runt相关转录因子2(Runx2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)上游引物、下游引物合成(无锡英纽瑞生物医药科技有限公司，批号：20170427、20170409、20170418、20170329、20170506)。小动物双能X射线骨密度仪(MEDIKORS公司，韩国，型号：InAlyzer型)，Micro-CT小动物活体影像系统(PerkinElmer公司，美国，型号：Quantum GX型)，离心机(Thermo Scientific公司，美国，型号：Sorvall ST 40R型)，全自动酶联免疫吸附分析仪(Tecan公司，瑞士，型号：Freedom EVO 75型)，核酸蛋白测定仪(Eppendorf公司，德国，型号：BioPhotometer D30型)，实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司，美国，型号：iQ5型)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 经1周适应性饲养后，将所有大鼠编号，之后按随机数字表法分为对照组13只及造模组65只。所有大鼠均禁食12 h，不禁水，称重后给予0.2%戊巴比妥钠溶液10 mL/g，腹腔注射以麻醉大鼠，麻醉满意后将大鼠仰卧位固定于手术台上，下腹部常规备皮、消毒、铺巾，于腹白线处作长度为2 cm的纵切口，逐层打开腹腔，造模组暴露两侧卵巢组织并切除，将卵巢周围的血管以及输卵管结扎；对照组大鼠仅暴露卵巢而不行切除术；依次缝合伤口，消毒。所有大鼠给予青霉素，每天10万单位，腹腔注射，连续7 d以预防感染。手术12周后，采用InAlyzer型小动物双能X射线骨密度仪测定大鼠4、5腰椎及左、右股骨骨密度(Bone Mineral Density，BMD)，造模组BMD值低于对照组，差异有统计学意义，即为骨质疏松模型建立成功[6]。实验过程中意外死亡或造模失败的大鼠及时予以补充。然后将造模成功大鼠随机分为模型组、阿仑膦酸钠组及补骨脂素低、中、高浓度组，每组13只。

1.2.2 给药方法 模型组及对照组分别给予双蒸水5 mL/kg灌胃；阿仑膦酸钠组给予0.2 mg/mL阿仑膦酸钠溶液5 mL/kg灌胃，1次/周；补骨脂素低、中、高浓度组分别给予0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL的补骨脂素溶液5 mL/kg灌胃。各组大鼠均给药12周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 大鼠BMD检测 末次给药第2天，称重后0.2%戊巴比妥钠溶液15 mL/g，腹腔注射以麻醉大鼠，采用In Alyzer型小动物双能X射线骨密度仪检测大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD。

1.2.3.2 Micro-CT测定大鼠骨形态学指标 BMD检测完成后，采用Quantum GX型Micro-CT小动物活体影像系统扫描大鼠右侧股骨，扫描参数为：电压60 kV，功率40 W，4帧，每转0.72°；用配套软件进行整体和局部重建，截取二维、三维及局部骨小梁图片，同时分析测定骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁数量(Tb.N)。

1.2.3.3 酶联免疫吸附试验法检测血清OPG、BGP水平 Micro-CT检测完成后，打开腹腔，自腹主动脉取血4 mL，置于含有肝素的抗凝管内，1 200×g离心10 min，分离血清，保存于-80 ℃冰箱内备检；取冻存的血清，迅速解冻并恢复至室温，按照酶联免疫吸附试验法检测试剂盒说明书进行操作，采用Freedom EVO 75全自动酶联免疫吸附分析仪，通过酶联免疫吸附试验法检测血清OPG、BGP水平[7]。

1.2.3.4 免疫组织化学法检测大鼠骨组织OPG、BGP水平 处死大鼠，取双侧股骨组织，其中左股骨组织用10%中性甲醛进行固定，然后采用脱钙剂进行脱钙[8]，常规脱水、透明、石蜡包埋，制成厚度为5 μm的石蜡切片→常规采用二甲苯脱蜡→梯度浓度乙醇逐级水化→3%过氧化氢处理20 min，使内源性过氧化氢酶消除→磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)。洗片3次，5 min/次→胰蛋白酶处理切片30 min→PBS洗片3次，5 min/次→根据免疫组织化学试剂盒，采用1∶1 000稀释的兔抗OPG、BGP一抗处理切片，室温2 h→PBS洗片3次，5 min/次→1∶2 000稀释的二抗处理切片，室温30 min→PBS洗片3次，5 min/次→试剂盒内的卵白素-生物素-酶复合物染色(ABC)试剂处理切片1 h→PBS洗片3次，5 min/次→用DAB显色试剂盒使切片显色→常规脱水、透明、中性树脂封固。在光学显微镜下对染色结果进行观察，OPG、BGP表达阳性的细胞被染成棕黄色，每张切片随机选取5个高倍视野(×400)采集图像，用Image J软件分析OPG、BGP蛋白表达的平均光密度值(IOD)[7]。

1.2.3.5 实时定量PCR法检测大鼠骨组织Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表达水平 右股骨组织用生理盐水浸湿，保存于-80 ℃冰箱内→将冻存的股骨组织剪碎后液氮研磨成粉→加入TRIzol溶液，充分匀浆10 min→按照RNA抽提试剂盒的说明操作提取总RNA→用焦碳酸二乙酯水溶解RNA→采用BioPhotometer D30型核酸蛋白测定仪检测总RNA浓度和纯度→按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，把RNA逆转录成为cDNA→于冰上配制PCR液(含SYBR荧光染料10 μL+Lrp6 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、Runx2 mRNA以及内参GAPDH上、下游引物各0.4 μL+cDNA模板2 μL+灭菌蒸馏水2 μL)→采用iQ5型实时荧光定量PCR仪进行引物扩增，反应条件为：95 ℃预变性5 min，40个循环(95 ℃，15 s→60 ℃，15 s→72 ℃，32 s)→获得Lrp6 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、Runx2 mRNA以及内参GAPDH生成溶解曲线，计算Lrp6 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、Runx2 mRNA的相对表达量[9]。

2 结果

2.1 各组大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD比较 与对照组比较，模型组大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD均较高，且补骨脂素低浓度组<补骨脂素中浓度组<补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD比较

2.2 各组大鼠Tb.Sp、Tb.Th及Tb.N比较 与对照组比较，模型组大鼠Tb.Sp显著升高，Tb.Th、Tb.N明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠Tb.Th、Tb.N均较高，且补骨脂素低浓度组<补骨脂素中浓度组<补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠Tb.Sp均较低，且补骨脂素低浓度组>补骨脂素中浓度组>补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2,图1。

表2 各组大鼠Tb.Sp、Tb.Th及Tb.N比较

图1 各组大鼠骨组织形态学Micro-CT观察结果

2.3 各组大鼠血清OPG、BGP水平比较 与对照组比较，模型组大鼠血清BGP水平显著升高，OPG水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠血清OPG水平均较高，且补骨脂素低浓度组<补骨脂素中浓度组<补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠血清BGP水平均较低，且补骨脂素低浓度组>补骨脂素中浓度组>补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清OPG、BGP水平比较

2.4 各组大鼠骨组织OPG、BGP表达水平比较 与对照组比较，模型组大鼠骨组织BGP表达水平显著升高，OPG表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠股骨组织OPG表达水平均较高，且补骨脂素低浓度组<补骨脂素中浓度组<补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠股、骨组织BGP表达水平均较低，且补骨脂素低浓度组>补骨脂素中浓度组>补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4，图2、3。

表4 各组大鼠股、骨组织OPG、BGP表达水平比较

图2 各组大鼠骨组织OPG表达结果(免疫组织化学染色，×400)

图3 各组大鼠骨组织OPG表达结果(免疫组织化学染色，×400)

2.5 各组大鼠骨组织Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表达水平比较 与对照组比较，模型组大鼠骨组织GSK-3β mRNA表达水平显著升高，骨组织Lrp6、β-catenin、Runx2 mRNA水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠骨组织Lrp6、β-catenin、Runx2 mRNA表达水平均较高，且补骨脂素低浓度组<补骨脂素中浓度组<补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠骨组织GSK-3β mRNA表达水平较低，且补骨脂素低浓度组>补骨脂素中浓度组>补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5，图4。

表5 各组大鼠骨组织Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表达水平比较

图4 各组大鼠骨组织Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表达结果

3 讨论

中医认为，OS属于“骨痿”“腰痛”“骨痹”“骨枯”等范畴[10]，属于本虚标实之证，本虚为肝肾气血亏虚，标实为痰饮、瘀血、气滞，肾主骨生髓，肾精亏虚则骨髓生长乏源，骨骼失于濡养，致骨枯骨痿，肾虚日久出现瘀血、气滞等，可影响骨的气血运行，进一步加重病情，骨治疗上应以补肾为主，兼以活血行气。补骨脂属于补益药，味辛苦，性大温，归肾、脾经，有补肾壮阳、温脾止泻等功效，临床应用广泛。刘振海等[11]研究发现，补骨脂常作为中药复方中的一味药用于肝肾不足型OS的治疗。现代药理研究显示，补骨脂内含有香豆素类、单萜酚类、黄酮类等多种活性成分，具有升高白细胞延缓老年痴呆进程、改善细胞免疫功能、抗骨质疏松、抗肿瘤、调节肾上腺皮质功能、抗菌抗病毒等多种药理作用[12]。补骨脂素为补骨脂中的呋喃香豆素类化合物，被认为是补骨脂内抗骨质疏松的主要有效成分，杨琳等[13]研究发现，补骨脂素能通过上调骨组织转化生长因子-β的表达水平，来促进骨形成过程，发挥对去势骨质疏松雌鼠的治疗作用。邢贞武[14]的体外研究则发现，补骨脂素能够激活骨髓间充质干细胞的Notch信号通路，促进成骨细胞分化，从而影响绝经后骨质疏松发展。由此可见，补骨脂素可以通过多种途径发挥抗骨质疏松作用，但具体机制尚未完全明确，需要更全面地进行研究。

本研究采用不同浓度的补骨脂素对去势OS大鼠模型进行治疗，结果发现，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD及骨组织Tb.Th、Tb.N均较高，Tb.Sp均低于模型组，且药物浓度越高，变化幅度越大，BMD是评价OS治疗效果的主要指标，Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp等骨形态学指标则可反映骨微细结构的变化，该结果表明补骨脂素能够有效增加OS大鼠BMD，同时改善骨组织的微细结构和骨强度，且补骨脂素浓度越高作用效果越好。血清骨代谢相关指标研究结果显示，补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠血清及骨组织OPG水平高于模型组，BGP水平低于模型组，且补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组改变最为明显，骨质疏松的发生是骨形成与骨吸收失衡的结果，BGP由成骨细胞合成分泌，为骨转换标志，能够反映骨更新率，绝经后OS属于高转换型，故该病发生后BGP处于较高水平；OPG是由成骨细胞分泌的糖蛋白，抑制破骨细胞分化、成熟并诱导其凋亡，从而抑制骨吸收，加速骨形成，发挥骨保护作用[15]。该结果表明高浓度的补骨脂素能够有效调节骨形成和骨吸收过程，保护骨组织。

Wnt/β-catenin信号通路是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要途径，能影响成骨细胞活性和功能，参与骨形成和骨代谢过程[16-17]，在骨质疏松的发生发展过程中也起到重要作用。Lrp6、GSK-3β和β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的主要分子，一般认为，Wnt/β-catenin信号通路被激活后，细胞膜上的Wnt能够与Lrp6特异性结合，形成的复合体可以促使GSK-3β磷酸化并丧失活性，无法促进β-catenin磷酸化，从而引起细胞内β-catenin积聚，然后进入细胞核内，控制相关基因转录，激活Wnt下游靶基因Runx2，Runx2为骨形成和发育的必要基因[18-21]，能调节成骨细胞分化并促进其成熟。若Wnt/β-catenin信号通路被抑制，则成骨细胞分化受到影响，可导致骨质疏松发生。本研究发现补骨脂素低、中、高浓度组及阿仑膦酸钠组大鼠骨组织Lrp6、β-catenin、Runx2 mRNA表达水平高于模型组，GSK-3β mRNA表达水平低于模型组，且补骨脂素高浓度组和阿仑膦酸钠组变化最明显，表明补骨脂素能通过激活Wnt/β-catenin信号通路来促进成骨细胞分化，这可能是补骨脂素发挥抗骨质疏松的作用机制之一。

综上所述，补骨脂素能剂量依赖性地提高OS大鼠的BMD，提高血清及骨组织BGP水平，降低BGP水平，增加骨组织骨小梁厚度和数量，降低骨小梁分离度，其作用可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。