基于网络药理学的鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎的分子机制研究

刘 畅 张慧月 聂 晶 刘丽慧 张 荻 吴记勇

(山东省第二人民医院药学部，济南，250022)

过敏性鼻炎(Allergic Rhinitis，AR)又被称为变应性鼻炎，是临床较为常见的鼻腔黏膜变应性疾病。AR分为常年性和季节性，常年性AR，致敏物质多为尘螨、动物脱屑等；季节性AR，致敏原多为花粉。以阵发性喷嚏、清水样涕、鼻痒和鼻塞为临床表现，可伴双侧鼻黏膜苍白、肿胀、下鼻甲水肿，眼结膜充血、眼部水肿。AR病程长、易反复，不仅降低患者的生命质量，还加重患者的经济负担。单纯西药治疗如糖皮质激素、抗组胺药、抗白三烯药、减充血剂、抗胆碱药等可在一定程度上缓解病情，但易复发且远期效果不理想[1]。

鼻渊通窍颗粒是由宋代严用和的《济生方》所载“苍耳散”的基础上加味而成，组方配伍严谨、合理[2]。鼻渊通窍颗粒由辛夷、苍耳子(炒)、麻黄、白芷、薄荷、藁本、黄芩、连翘、野菊花、天花粉、地黄、丹参、茯苓、甘草，共计14味中药。具有疏风清热，扶正祛邪、益气固表、宣肺通窍之功效，用于急鼻渊属外邪犯肺证，证见前额或颧骨部压痛、鼻塞时作、流涕黏白或黏黄，或头痛，或发热，苔薄黄。以往随机对照试验临床研究表明鼻渊通窍颗粒联合糖皮质激素治疗过敏性鼻炎的效果明显，优于单药治疗[3]。然而，鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎分子机制不明，有待进一步研究。

网络药理学是基于系统生物学理论，利用生物网络分析法构建药物-成分-靶点-疾病网络，以网络靶标为切入点，从药物网络稳态角度分析药物成分与疾病靶点网络之间的关系及动态变化规律，可提升临床药物研究实验成功率，节约药物研发成本[4]。本文基于网络药理学理论，对鼻渊通窍颗粒所含已知有效成分治疗过敏性鼻炎的分子机制进行探索。通过构建药物成分、潜在靶点与过敏性鼻炎疾病之间的网络，为鼻渊通窍颗粒在过敏性鼻炎的临床治疗和相关科学研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 鼻渊通窍颗粒所含的化学成分及作用靶点的获取 本研究借助中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，获取鼻渊通窍颗粒中辛夷、苍耳子、麻黄、白芷、薄荷、藁本、黄芩、连翘、野菊花、天花粉、地黄、丹参、茯苓、甘草所含的化学成分，通过药物信息数据库DrugBank(http://www.drugbank.ca/)获得鼻渊通窍颗粒所含成分的作用靶点。

1.2 过敏性鼻炎疾病靶点的获取和鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎的靶点预测 通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以“Allergic Rhinitis”为关键词，获得过敏性鼻炎疾病靶点。利用R语言，找出1.1项下转化为基因简称的药物成分靶点与疾病靶点的共同靶点，作为鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎的潜在靶点。

1.3 鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)构建 将鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎的潜在靶点导入STRING据库(https://string-db.org/)，物种选择为“Homo Sapiens”，选择隐藏网络之外游离节点，设置置信度评分为自定义值>0.40，得到鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎的PPI网络，并利用R语言计算各节点的度值得到柱形图进行可视化显示。

1.4 “鼻渊通窍颗粒成分-潜在靶点-过敏性鼻炎”的网络构建 将鼻渊通窍颗粒所含的化学成分和其治疗过敏性鼻炎的潜在靶点数据储存为.txt格式，导入网络可视化软件Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/)，构建鼻渊通窍颗粒成分-潜在靶点-过敏性鼻炎的可视化PPI网络图。

将209个鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎的潜在靶点导入STRING数据库，利用本文1.3项下的方法，最终得到鼻渊通窍颗粒-AR的PPI网络。网络中节点代表靶点，边代表靶点间的互作关系，边数越多的节点表明其在网络中越关键，各节点的互作关系具有相关文献证据支持，黄色边表示证据来源于文本挖掘、黑色为共表达、浅蓝色为蛋白同源性和橙色为基因融合等。

鼻渊通窍颗粒潜在活性成分-靶点”网络。不同颜色表示不同药物，其中棕色代表黄芩、粉色代表辛夷、黄色代表丹参、青色代表藁本、墨绿色代表茯苓、粉色代表苍耳子、浅粉色代表天花粉、橘黄色代表甘草、蓝色代表地黄、浅绿色代表野菊花、深绿色代表薄荷，深蓝色代表白芷，紫红色代表多种药物共有靶点，绿色三角代表药物与疾病的共有靶点。

鼻渊通窍颗粒存在一个成分同多个靶点相互作用，以及不同成分共同作用于同一个靶点的现象。这体现了中药多成分、多靶点、多环节作用复杂疾病治疗机制。网络中，节点的度值表示网络中同其他节点相连的数目，利用节点度值确定网络关键节点是目前网络分析的重要手段。根据药物网络节点度(Degree，DC)参数，筛选关键成分与靶点。

1.5 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 通过R语言，使用org.Hs.eg.Db、Colorspace、DOSE、clusterProfiler和Pathview等R包，进行鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎的包含生物学过程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和细胞组分(Cellular Component，CC)三部分的GO功能富集分析，以及鼻渊通窍颗粒调控的潜在靶点在疾病信号通路中的富集程度，并进行可视化展示。

鼻渊通窍颗粒治疗AR的KEGG通路结果，其中方格部分代表整条通路中出现的节点，红色部分表示该节点出现在鼻渊通窍颗粒调控AR的疾病网络中。

1.6 鼻渊通窍颗粒潜在靶点-通路分析 利用Cytoscape 3.7.2软件构建鼻渊通窍颗粒潜在活性成分靶点-信号通路网络图。将得到的通路条目、靶点信息导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制得到靶点-通路图，其中红色代表通路，橙色代表靶点，图形的大小表示富集的显著程度，图形越大表明富集越显著。

1.7 鼻渊通窍颗粒潜在活性成分-靶点的分子对接 在PDB数据库中下载PTGS2(PDB ID：1PRH)、PTGS1(PDB ID:5IKV)及AR密切相关的血清因子IgE(PDB ID:5ANM)抗体3D结构的pdb格式文件，运用Discover Studio软件对蛋白质进行去水、加氢，从PubChem数据库中下载各成分结构，将将鼻渊通窍颗粒治疗AR潜在化学成分槲皮素、芹菜素、山柰酚的药物分子及处理后导入AutoDock软件进行分子对接并计算潜在活性成分和潜在靶点之间的结合能以预测他们的结合活性。

本研究将鼻渊通窍颗粒治疗AR潜在化学成分槲皮素、芹菜素、山柰酚同潜在靶点PTGS2(PDB ID：1PRH)、PTGS1(PDB ID:5IKV)及AR密切相关的血清因子IgE(PDB ID:5ANM)抗体进行分子对接计算潜在活性成分和潜在靶点之间的结合能，结合能的绝对值越高，结合形成的构象越稳定。在AutoDock环境下，结合能的绝对值>0.5说明该结果有意义，结合能绝对值>5，表明结果良好。

2 结果

2.1 鼻渊通窍颗粒所含成分获取结果 通过TCMSP数据平台，检索辛夷、苍耳子(炒)、麻黄、白芷、薄荷、藁本、黄芩、连翘、野菊花、天花粉、地黄、丹参、茯苓、甘草中化合物，除重后鼻渊通窍颗粒的主要化合物有849种。见表1。2.2 鼻渊通窍颗粒治疗过敏鼻炎潜在靶点获取结果 通过药物信息数据库DrugBank获取鼻渊通窍颗粒所含成分靶点共计543个，利用GeneCards数据库获得AR靶点1 865个。最后，通过R语言运行VennDiagram程序，得到药物成分靶点与AR的共同靶点209个，作为鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎的潜在靶点，表明鼻渊通窍颗粒可过调控多个靶点，发挥治疗AR的作用。见图1。

图1 鼻渊通窍颗粒治疗AR的潜在靶点

2.3 鼻渊通窍颗粒治疗过敏性鼻炎PPI分析结果 整个网络包含边4 196条，节点数207个，平均节点度值40.5。见图2。

图2 鼻渊通窍颗粒-AR的PPI网络

结果显示，IL6、ALB、INS、AKT1、VEGFA、MAPK3、IL1B、STAT3、PTGS2等靶蛋白的节点度值高，表明这些靶蛋白在网络中处于关键地位，是其他节点之间的连接纽带。见图3。

图3 鼻渊通窍颗粒-AR关键节点信息柱形图

2.4 “鼻渊通窍颗粒成分-潜在靶点-过敏性鼻炎”的网络构建结果 通过网络分析得到鼻渊通窍颗粒成分与潜在靶点相互作用关系共计1 073个。结果显示，鼻渊通窍颗粒所含成分中的，槲皮素(MOL000098)、芹菜素(MOL000008)、山柰酚(MOL000422)、熊果酸(MOL000511)、迷迭香酸(MOL011865)和基因中PTGS2、PTGS1、CHRM2、CHRM3、ADRB2等的节点度值较高，是该网络的重要节点，表明其可能是鼻渊通窍颗粒治疗AR的关键。见图4。

图4 鼻渊通窍颗粒潜在活性成分-潜在靶点-过敏性鼻炎网络

表2 鼻渊通窍颗粒成分-潜在靶点-过敏性鼻炎的关键节点

2.5 GO富集分析 GO富集分析得出2 320个生物学过程(BP)，涉及脂多糖应答、细菌产生、细胞因子、生物刺激、炎症反应、营养水平、氧化应激等过程的调控；69个细胞组分(CC)，涉及细胞质、细胞膜、膜小凹、膜区、膜筏、微血管、特异性颗粒、溶酶体等。138个分子功能(MF)，涉及细胞因子受体、核受体、肾上腺素能受体、趋化因子受体、G蛋白偶联受体、转录因子、血红素等。见图5～7。纵坐标为GO名称，横坐标表示基因富集数目，颜色表示基因富集的显著性。

图5 鼻渊通窍颗粒关键靶点BP柱形图

图7 鼻渊通窍颗粒关键靶点MF柱形图

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析得到24条通路，其共同靶点主要富集于促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)、低氧诱导因子1(Hypoxia Inducible Factor 1，HIF-1)、钙信号通路、趋化性细胞因子、叉头转录因子、环磷酸腺苷(Cyclic AMP，cAMP)、核因子κB(Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB)等信号通路。纵坐标为KEGG名称，气泡的大小表示基因富集数目，越大则富集基因数目越多，颜色表示基因富集的显著性，越红则富集越显著。见图8。

图8 鼻渊通窍颗粒潜在靶点KEGG通路富集分析气泡图

2.6 鼻渊通窍颗粒潜在靶点-通路分析结果 富集在各通路上的关键靶点主要有:AKT1、MAPK1、MAPK3、RELA等。见图9。

图9 鼻渊通窍颗粒作用靶点-通路分析

结果显示，鼻渊通窍颗粒所含的化学成分可通过调节细胞能量代谢与物质转换、细胞周期增殖、细胞分裂与分化、细胞衰老与凋亡、释放抗体抑制病毒复制、免疫调节、抑制肿瘤细胞的增殖和分化等多通路对AR进行治疗。见图10。

图10 鼻渊通窍颗粒治疗AR相关通路作用靶点

2.7 鼻渊通窍颗粒潜在活性成分-靶点的分子对接结果 由鼻渊通窍颗粒潜在活性成分-靶点的分子对接结果可知，在AutoDock环境下，分子对接结合能的绝对值>0.5说明该结果有意义，结合能绝对值>5，表明结果良好。由表3和图11可知，槲皮素、芹菜素和山柰酚与受体蛋白PTGS1、PTGS2和IgE形成构象能量低，结合构象稳定。

图11 鼻渊通窍颗粒潜在活性成分-靶点的分子对接

表3 鼻渊通窍颗粒潜在活性成分-靶点的分子对接结果——蛋白/PDB ID结合能(kcal/mol)

3 讨论

中医认为慢性鼻窦炎属“鼻渊”范畴，治疗应以宣肺通窍为主，鼻渊通窍颗粒可发挥宣肺通窍功效。网络药理学研究发现，鼻渊通窍颗粒含有的槲皮素、芹菜素、山柰酚、熊果酸、迷迭香酸可能是鼻渊通窍颗粒治疗AR的活性成分。其中，槲皮素、芹菜素、山柰酚均为黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基和提高机体免疫的功能。槲皮素是一种富含抗氧化剂的天然多酚类黄酮，具有抗过敏、抑制组胺和促炎症介质生成功能，能够调节Th1/Th2的稳定性，减少B细胞释放抗原特异性IgE抗体，适用于治疗过敏性疾病[5-6]；芹菜素作为生物黄酮类化合物，具有良好的抗过敏作用潜力，其对抗卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)诱导的AR具有潜在作用机制，芹菜素通过抑制Th2细胞应答的表达和激活Th1细胞应答来调节Th1/Th2平衡，在OVA诱导的AR小鼠模型中发挥抗过敏作用[7]；炎症反应与多种疾病的发展都密切相关，因此，控制炎症发展在炎症治疗中尤为重要，山柰酚具有明显抗炎作用，研究发现，山柰酚能够显著抑制脂多糖诱导的人单核细胞THP-1的MAPK通路表达，降低巨噬细胞衍生趋化因子、γ干扰素诱导蛋白-10、白细胞介素-8等炎症介质的产生，从而有效抑制炎症的发生。此外，Cao等[8]的研究也发现山柰酚可作为治疗非IgE介导的过敏反应或炎症的候选药物；熊果酸是一种存在于多种植物中的五环三萜类化合物，宋瑗瑗等[9]通过对熊果酸C28位进行结构修饰得到熊果酸衍生物，分子对接研究发现，该衍生物可能通过影响白细胞介素-1受体相关激酶1表达，从抑制炎症反应；有研究发现，富含迷迭香酸的紫苏提取物可抑制小鼠过敏性免疫球蛋白反应，为证实其疗效，一项随机对照试验研究筛选29例有2年以上病史轻度AR患者，在为期21 d的给药观察得出高剂量给药组AR改善率高达70%，表明迷迭香酸能有效改善轻度AR[10]。

通过PPI网络分析研究可知，PTGS2、PTGS1、CHRM2、ADRB2、NOS2等靶蛋白节点度高，是鼻渊通窍颗粒所含化学成分与AR疾病基因网络的核心靶点，也是其他节点之间的连接纽带。文献研究发现，PTGS2、PTGS1和NOS2与炎症正相关，前列腺素内过氧化物合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase,PTGS)又称环加氧酶，是前列腺素生物合成中的关键酶。PTGS有2种同工酶：组成型PTGS1和诱导型PTGS2。通常，他们由特定的刺激事件调节，与炎症反应和相关前列腺素生物合成相关。一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)2是NO生成的关键酶，一项随机对照试验研究探讨NOS2基因单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)与单纯尘螨过敏性鼻炎发生的相关性，通过采集受试者外周静脉血，提取基因组DNA研究发现单纯尘螨过敏性鼻炎患者NOS2基因单核苷酸多态性改变，揭示了NOS2可能是中国汉族人群单纯尘螨过敏性鼻炎易感基因[11]。

KEGG通路富集分析结果显示，鼻渊通窍颗粒治疗AR的潜在基因显著富集在MAPK、HIF-1、NF-κB、cAMP等信号通路。MAPK是信号从细胞表面传递至胞核内部的重要传递者，能被不同点胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激等激活，同时具有调节细胞生长、分化、适应环境及炎症反应等多种细胞生理和病理过程；HIF-1是缺氧条件下哺乳动物体内存在的一种快速转录因子，随胞内氧浓度变化而调节靶基因表达。它能促进血管内皮细胞生产因子，诱导型一氧化氮合成酶等基因表达，在免疫和炎症反应中发挥关键性作用。研究证实，过敏伴随的炎症反应均需要HIF-1活化，在炎症组织中，炎症介质均会引起HIF-1水平上升，该指标能支持炎症细胞能力代谢，促进炎症介质表达[12]；核因子κB一种重要的转录因子，它是介导细胞内信号转导最重要的核转录因子，可调节炎症介质和免疫因子。江雪等[13]研究发现，在AR患者中核因子κB水平显著升高，表明该信号通路在AR发病过程中具有重要作用。第二信使cAMP是细胞内信息传递过程中细胞功能重要的调节物质。研究发现，健康人体内cAMP的代谢呈动态平衡，炎症反应时，二者比值发生变化，因此cAMP可以作为AR的疗效评价指标，对AR治疗具有指导意义[14]。

为进一步研究鼻渊通窍颗粒治疗AR药效物质基础，本研究采用分子对接技术对鼻渊通窍颗粒治疗AR关键成分及靶点进行分子对接验证。在AutoDock环境下，分子对接结合能的绝对值>0.5说明该结果有意义，结合能绝对值>5，表明结果良好。槲皮素、芹菜素和山柰酚与受体蛋白PTGS1、PTGS2和IgE形成构象能量低，结合构象稳定。

综上所述，本研究基于网络药理学方法，对鼻渊通窍颗粒治疗AR的分子机制进行挖掘并分析，结果表明，鼻渊通窍颗粒所含化学成分槲皮素、芹菜素、山柰酚、熊果酸、迷迭香酸可能是该方治疗AR的关键，各组分可能通过PTGS2、PTGS1、CHRM2、ADRB2、NOS2等靶点介导MAPK、HIF-1、NF-κB、cAMP信号通路，发挥治疗AR作用。然而，药物在体内作用受身体生理功能、年龄、性别以及体内的吸收、分布、代谢和排泄因素影响。另外，网络药理学研究基于开源数据库，其研究存在一定局限性。网络药理学研究虽处于初级阶段，但其给传统中药的研究带来新的现代化思路。随着系统生物学、生物信息学等学科的发展以及中药信息数据库的完善，中药复方网络药理学多成分、多靶点治疗疾病的机制将会进一步揭示，不断推进药学研究发展。