静脉管壁重塑在下肢深静脉血栓后综合征发病机制中的研究进展

张琳杰 王鹏辉 杨成昊 崔超毅 陆信武 殷敏毅

流行病学资料显示，约有20%～50%的患者会在深静脉血栓(deep vein thrombosis,DVT)形成后出现相应的深静脉血栓后综合征(post-thrombotic syndrome,PTS)症状，包括肢体疼痛、沉重感、疲劳、下肢水肿、瘙痒和静脉性跛行；约10%的患者会发展至静脉性溃疡，是PTS最严重的临床表现。PTS的病理生理机制尚未被完全阐明。目前主流的观点认为，PTS可能是由于DVT形成后，静脉血流被部分或完全阻断，使流出道梗阻、静脉瓣返流并持续到急性期，导致静脉处于高压状态，从而引起各种症状。但随着静脉血栓的部分或完全再通，流出道梗阻缓解，部分患者的PTS症状仍然不断加重，甚至有需要截肢的可能。这些临床现象提示，静脉血栓可能在一定程度上对静脉造成了不可逆的损伤，而这种损伤极有可能体现在静脉管壁之中。本文从DVT形成后的细胞成分、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分、分子成分3个方面对目前的PTS静脉管壁重塑机制进行综述。

1 PTS的病理性静脉管壁重塑概述

PTS患者股静脉阻塞节段切开可见管壁内侧有大量的纤维化痕迹，组织病理学检查结果显示,管壁中有大量胶原异常沉积，其中80%为Ⅰ型胶原，其余为Ⅲ型胶原，并伴有严重营养不良性钙化[1]。上述结果提示，PTS患者管壁重塑过程中ECM代谢失调，造成管腔粘连和管壁纤维化改变，从而严重影响静脉顺应性，这可能是血栓再通后症状仍然加重的原因之一。进一步探索静脉管壁重塑机制可为PTS的预防和早期治疗提供新的干预靶点。

静脉血管重塑是一种活跃的血管结构改变过程，涉及至少4个细胞过程——细胞生长、细胞死亡、细胞迁移和ECM的产生或降解，且依赖于局部生成的生长因子、血管活性物质和血流动力学的刺激。研究发现，DVT形成两个月后，血栓发生透明化，伴有中央弯曲管腔，提示成纤维细胞等产生胶原的初步积累。密集排列的胶原纤维中含有稀疏的免疫细胞，排列较松散的胶原束与新生血管形成有关。而后逐步发生血栓再通，但是部分以静脉管壁纤维化、顺应性降低为代价，从而引起静脉功能不全。病理性管壁重塑作为不可或缺的机制参与其中，逐渐演变为PTS。

2 细胞成分

2.1 内皮细胞(endothelial cell,EC)及内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC) EC是静脉管壁组织与血液之间的第一道屏障，参与物质交换、凝血、抗凝、纤维蛋白溶解(简称纤溶)等多种病理生理过程。EPC是EC的前体细胞，在DVT的病理刺激下，可从骨髓动员到外周血中参与损伤血管的修复和血栓的溶解。

EC和EPC在PTS的静脉壁重塑中可发挥双重作用[2]。一方面，完整EC的快速恢复可能阻止了静脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)参与病理性管壁重塑的过程。有研究[3]显示，EC和EPC产生的NO可以抑制VSMC的增殖，增加EPC数量，加速血管内皮化，遏制病理性血管壁重塑[4]。Méndez-Barbero等[5]总结了EC与VSMC间信号交流的方式，提出两者间信号交流失调参与病理性血管重塑的机制假说。另一方面，有研究指出EPC产生的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和尿激酶型纤溶酶原激活物可调节血管壁的胶原和基质代谢，理论上可使血管壁厚度增加，僵硬度增高，加重PTS。

此外，EC还有可能在TGF-β等分子的诱导下进行内皮-间充质转化(endothelial-mesenchymal transition,EndMT)，促进血管壁钙化及纤维化，造成静脉闭塞，但该作用仅在门静脉纤维化中得到证实，而在DVT形成中尚须进一步验证[6-8]。

2.2 VSMC VSMC位于静脉的中膜和外膜，是具有高度可塑性的特化细胞。在血栓等应激条件下，高度分化的VSMC可重新进入细胞周期并发生去分化，转化为合成型VSMC，并发生增殖和迁移行为。

血管内膜增厚是DVT后不良静脉管壁改变的标志之一，其特征是血管壁中平滑肌过度浸润，ECM过度沉积[9]。作为慢性静脉管壁损伤中最主要的血管驻留细胞，VSMC增殖并失去部分收缩性，表型转化为合成型，通过释放MMP等蛋白酶和TGF-β等生长因子以促使ECM中的胶原代谢发生紊乱[10]，导致管壁出现肥厚区，收缩性降低，刚性增高，弹性受损，使静脉壁顺应性更低，保持生理形状的能力更差[11]。

2.3 肌成纤维细胞(Myofibroblasts) 肌成纤维细胞是一个异质性的细胞群，具有多种来源的病理特异性前体细胞，包括常驻的成纤维细胞和血管壁的各种细胞，如周细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。纤维化疾病中ECM顺应性降低的主要原因是被激活的成纤维细胞使ECM合成和重塑失调。在病理状态下，这些成纤维细胞去分化为肌成纤维细胞，并且这种激活是持续的，并不会发生凋亡或静止[12]。肌成纤维细胞兼具分泌和收缩表型，其在局部组织中施加高的收缩力，结合分泌导致过量的ECM沉积，局部微环境刚度便逐渐增加[13]，而这很可能是PTS管壁顺应性降低的机制之一。

2.4 血小板 血小板富含TGF-β和纤溶酶原激活物(plasminogen activator-1,PAI-1)，前者是已知的组织纤维化的驱动因子，后者则是纤溶的抑制剂[14-15]。最近一项针对循环血小板参与PTS血管重塑的研究[16]发现，与对照组相比，血小板耗竭的实验组中静脉管壁的增厚程度更低，病理性管壁重塑更少，这种作用可能是通过血小板源性TGF-β的减少而发生。此外，实验组中血栓的纤维化程度更低、VSMC对血栓侵袭程度更低，这也提示了血小板极有可能参与到血栓后组织纤维化进程中，并参与VSMC的表型转化调节。

2.5 单核细胞和巨噬细胞(monocyte/macrophage，Mo/MØ) Mo/MØ是DVT形成后局部管壁炎症调节及血栓再通的重要细胞成分，也是MMP、TGF-β的重要来源之一。Myers等[17]研究发现，口服P-选择素抑制剂与静脉管壁硬化程度降低有关，同时介导Mo等炎症细胞的黏附聚集，间接提示Mo/MØ在DVT形成后静脉管壁纤维化损伤中起作用。此外，Mo能转分化为成纤维细胞，并通过产生趋化因子配体21(CCL21)引导封闭重构。CCL21是一种被趋化因子体(CCR)7识别的趋化因子，位于静脉壁某些间充质祖细胞(纤维细胞)的表面。在CCL21的引导下，纤维细胞可以侵入被阻塞的静脉壁中，通过释放MMP-2/MMP-9和沉积胶原等方式支持闭塞性重构[18]。

3 ECM和MMP

ECM是包围、支持组织和细胞的结构实体，Ⅰ型和Ⅲ型胶原是血管ECM的主要亚型。静脉管壁ECM可以动态地与VSMC、成纤维细胞等细胞相互作用。ECM中胶原蛋白和弹性蛋白的绝对数量和相对数量决定了血管的生物力学特性——弹性蛋白缺乏或胶原蛋白过剩导致静脉血管硬度增加和纤维化。

胶原溶解是正常静脉血栓再通过程中炎性管壁重塑的关键一环，MMP是主要参与者之一。Deatrick等[19]在DVT形成的小鼠瘀血模型中发现，静脉壁有类似于无菌性伤口愈合的晚期纤维化反应，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的基因表达增多，MMP-2和MMP-9基因表达和活性增高。MMP与静脉管壁的纤维化有较高相关性：Deatrick等[20]研究发现，MMP-9与DVT形成后静脉壁纤维化反应有关，MMP-9缺失与血栓损伤后中期(8 d左右)静脉壁胶原蛋白减少有关，但是这种效应在21 d左右就有所减弱，MMP-9水平增高可能增加静脉壁中的胶原蛋白沉积，促进纤维化的发生；相比于野生型大鼠，MMP-2基因敲除型大鼠管壁在8 d左右时胶原蛋白减少约35%，但是在21 d左右时无显著差异，表明MMP-2缺失与血栓形成后中期静脉壁胶原蛋白减少有关；此外，在MMP-9和MMP-2共敲除或MMP-9敲除联合使用MMP-2抑制剂的动物模型中，静脉壁的胶原蛋白沉积较单敲除MMP-2组显著减少，血栓后静脉壁也显著变薄，胶原蛋白沉积减少[21]。MMP-9与MMP-2是目前研究较多的2种MMP，两者对于管壁ECM中胶原纤维沉积的作用都有一定的时间窗，并且都可能对VSMC的迁移分化活性产生影响，从而介导管壁重塑的进程。

此外，小鼠模型证实体内骨髓p53可以通过增强炎症性管壁重塑调节静脉血栓再通，p53的基因缺陷可能导致静脉管壁ECM纤维化增加，MMP-2水平改变[22]。PTS相关基因多态性分析显示，MMP、IL-6、Toll样受体(TLR4、TLR9)、TIMP、胶原蛋白1型α2(COL1A2)、前胶原蛋白(procollagen)等基因与ECM纤维化改变有相关性[23]。但目前仍缺乏进一步的实验数据支持上述观点。

4 分子成分

4.1 TGF-β信号通路 TGF-β是一种组织修复相关的多功能生长因子。研究[24]结果表明，TGF-β通路与ECM相关基因表达及纤维化发生密切相关。VSMC、EC、肌成纤维细胞、巨噬细胞和一些血细胞(如血小板)被证明是TGF-β的主要来源。大量的临床前研究[25]已经证明，在不同的动物模型的不同器官中，抑制TGF-β信号通路具有抗纤维化作用。

研究[26]显示，TGF-β主要通过调节ECM代谢参与管壁重塑。在VSMC、EC和成纤维细胞中，即使在低水平下，TGF-β1也能增加ECM蛋白的合成，如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、胶原和PAI-1。TGF-β可减少MMP的生成，刺激组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)的表达，从而抑制MMP对ECM蛋白的降解作用，导致基质过度积累[26]。

TGF-β下游信号主要通过胞浆蛋白Smad传导，Smads复合物转运到细胞核中，充当转录因子，通过上调ECM完成关键基因的转录，如前胶原蛋白、FN、结缔组织生长因子(CTGF)和PAI-1，引起ECM代谢改变。动脉粥样硬化相关研究[27]结果显示，TGF-β-Smad3通路的下调可以通过VSMC调节ECM代谢，表明内源性Smad3在损伤反应中具有血管保护作用。动脉相关的研究显示，TGF-β可以诱导管壁收缩性重塑，但这些结论仍须在静脉管壁中进一步验证。

除了经典的Smad信号传导通路之外，TGF-β还可以激活其他通路中的细胞外周调节蛋白激酶(ERK)、p38、JNK等蛋白。在VSMC中，TGF-β信号可以激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员中的ERK。ERK与Smad之间存在一定联系，ERK可以使Smad1/2/3连接区的丝氨酸残基磷酸化。抑制ERK可以减少TGF-β信号激活的Smad磷酸化和下游的胶原生成启动子激活，这表明ERK活性对TGF-β的最佳应答是必要的[28]。完全抑制ERK通路可以下调MMP-9表达，这些都与血管重塑密切相关[29-30]。此外，GTP结合蛋白Rho家族中的RhoA则是Smad激活的调节器。转染显性阴性RhoA可阻断TGF-β1引起的Smad2和Smad3的磷酸化和核转位[31]。RhoA和p38 MAPK通过激活血清反应因子SRF、GATA和依赖于MEF2的增强子参与TGF-β1诱导的VSMC分化[32]。

TGF-β在细胞层面通过影响VSMC、肌成纤维细胞表型转化，从而对这些关键细胞的命运产生影响；在分子层面，TGF-β影响管壁中局部MMP等ECM代谢因子的表达水平，参与管壁重塑。在PTS易感患者中，血栓后的静脉管壁中由于慢性炎症刺激、ECM僵硬度增高等因素导致TGF-β信号促纤维化作用被放大。其机制可能是由于激活TGF-β的因素同时被放大、抑制TGF-β信号传导的通路被抑制，以及其他信号通路对TGF-β靶向促纤维化基因的协同作用[25]。TGF-β促纤维化机制在皮肤、肾、肝脏、肺中已有一定的研究基础，但是静脉中似乎少有涉及，具体的机制仍须进一步验证。

4.2 PAI-1 PAI-1是组织型纤溶酶原激活物和尿激酶型纤溶酶原激活物的主要生理抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶超家族。纤溶酶对于静脉血栓的再通具有非常重要的作用，PAI-1是纤溶酶的主要调节器之一。Baldwin等[33]发现，DVT形成后纤溶酶的活性改变可以导致不同的静脉壁反应，PAI-1的减少导致的纤溶酶活性增高，虽然静脉血栓再通有所改善，但是静脉壁却发生了更加严重的纤维化。随后的研究对玻璃体结合蛋白敲除大鼠DVT模型进行评估发现，循环PAI-1水平的增高对静脉壁纤维化具有保护作用，且与静脉壁MMP活性呈负相关。无论是PAI-1的配体玻璃体结合蛋白敲除还是转基因过表达，循环PAI-1水平增高都与血栓后静脉管壁纤维化程度降低有关[34]。

5 总结与展望

病理性静脉管壁重塑是PTS长期演变的重要一环，涉及EC、VSMC、粒细胞、MØ、血小板等细胞成分，以及众多细胞因子和信号通路的调节。早期静脉壁纤维化发生在与血栓直接接触后，粒细胞浸润管壁，随后Mo浸润，DVT形成后静脉壁早期损伤与胶原蛋白和弹性蛋白溶解有关[35]。后期静脉壁纤维化可能是由血栓新生血管和慢性炎症等其他因素驱动[36]。DVT形成后，不同时空条件下，不同的细胞通过复杂的分子交流，共同导致了病变段管壁僵硬、纤维化甚至闭塞。目前,PTS管壁重塑的研究聚焦于管壁纤维化机制，以ECM代谢和TGF-β为重点，探讨不同的细胞表型转变造成的管壁病理性结局。但是缺乏对DVT形成后不同时期的管壁中各种细胞成分及信号通路的研究。今后通过对相同时间窗内的各种细胞的作用及协调关系进行深入研究，进一步阐明DVT形成后不同阶段管壁的重塑反应，能够为深入探究PTS预防方法提供理论依据。