病原微生物负荷及炎症因子与颈动脉粥样硬化斑块稳定性的相关性研究

吴鉴今 黄 通 沈 旭 何天啸 曲乐丰

颈动脉粥样硬化斑块(carotid atherosclerotic plaque, CAP)的稳定性减弱时，可发生脱落，引起远端颅内动脉阻塞，造成缺血性脑卒中。约30%～50%缺血性脑卒中由斑块脱落诱发，因此CAP稳定性的早期评估和有效控制意义重大[1]。近期研究[2]结果显示，全身或局部持续感染引起的炎症反应可能与动脉粥样硬化进展及斑块稳定性减弱有关。2002年，Epstein[3]提出病原微生物负荷(pathogen burden, PB)的概念，即假设体内感染的病原微生物种类、数目与动脉粥样硬化的发生相关；从多种病原微生物的整体视角探讨感染在动脉粥样硬化发生、发展中的作用。人类软骨糖蛋白-39(YKL-40)是一种新型炎症标志物，为肝素和壳质酶结合的植物凝集素，可通过促进细胞黏附、血管平滑肌迁移和小血管形成，影响CAP的形成与发展。目前，尚缺乏PB和YKL-40与CAP稳定性的相关性研究。2013年起，本团队已着手建立CAP的临床生物样本库，收集病原微生物感染与CAP稳定性的相关数据。目前，样本库在不断丰富中，且长期随访纳入的样本队列。本研究通过回顾性分析前期收集CAP患者临床资料，旨在探索血清学和斑块组织学PB值及YKL-40等炎症因子与CAP稳定性之间的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集海军军医大学第二附属医院血管外科自2013年4月—2015年3月门诊收治的经颈动脉血管超声明确诊断为CAP，并收录于CAP临床生物样本库的232例患者资料，其中男130例、女102例，中位年龄67岁。纳入标准：①年龄范围40～85岁；②依据美国2011年多学科联合制订的颅外颈动脉与椎动脉治疗指南，颈动脉血管超声检查明确诊断为CAP；③患者及其家属均知情同意。排除标准：①合并炎症性疾病(如感染、自身免疫性疾病等)；②合并严重的肝脏或肾脏疾病；③恶性肿瘤；④意识不清或无法交流；⑤颈动脉闭塞。根据《颈动脉狭窄诊治指南》[1]的内容，收集符合手术指征且接受颈动脉内膜斑块切除术的58例患者的颈动脉斑块组织学资料。本研究经医院伦理委员会审核、批准(伦理号：2016SL017)。

1.2 方法

1.2.1 颈动脉情况评估及患者分组 由具有3年及以上临床经验的同一位超声科医师完成相关检查。依据世界超声医学与生物学联合会制订的共识[4]，对斑块致颈动脉狭窄程度进行评估，分为轻度狭窄(狭窄程度<50%)组(89例)、中度狭窄(狭窄程度50%～69%)组(71例)和重度狭窄(70%～99%)组(72例)。依据美国心脏协会(American Heart Association，AHA)分型[5]和《中国健康体检人群颈动脉超声检查规范》[6]对斑块的形态学、内部回声情况、表面纤维帽的完整性等进行综合分析，以评估斑块的稳定性，将患者分为血清学稳定斑块组(128例)和不稳定斑块组(104例)；同时，对接受颈动脉内膜斑块切除术的58例患者，按照超声和术后病理学检查结果，分为组织学不稳定斑块组(21例)和稳定斑块组(37例)。

1.3 观察指标

1.3.1 一般资料 患者的年龄、性别、BMI、合并症(高血压病、糖尿病、冠心病)、吸烟史，LDL-C、TC、TG、高密度脂蛋白(HDL)水平。

1.3.2 血清学病原微生物及炎症因子资料 患者禁食≥8 h，晨起空腹采血。检测的血清学病原微生物抗体，包括EB病毒抗体(EBV IgG)、单纯疱疹病毒1抗体(HSV1 IgG)、单纯疱疹病毒2抗体(HSV2 IgG)、巨细胞病毒抗体(CMV IgG)、幽门螺杆菌抗体(H.pyloriIgG)、肺炎衣原体抗体(CPN IgG)。血液标本交付检验科检测，如上述抗体水平超过Muliskan MK3酶标仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]检测数值的正常上限，则以阳性表示。PB值的计算方法为所有阳性抗体数目求和，例如某患者EBV IgG、H.pyloriIgG和CPN IgG阳性，即PB值记为“3”。血清学炎症因子包括超敏C反应蛋白(hs-CRP)和YKL-40，采用免疫散射比浊法检测标本hs-CRP表达水平，应用Human YKL-40/CHI3L1 ELISA LanpaiBio®[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]试剂盒检测YKL-40表达水平，结果以绝对值表示。

1.3.3 组织学病原微生物及炎症因子资料 颈动脉内膜斑块切除术后30 min内进行斑块的组织修整、编号和保存，以10%甲醛溶液行组织固定，并行免疫组织化学染色。检测组织斑块中是否存在EBV IgG、H.pyloriIgG、CMV IgG、CPN IgG的阳性表达。组织学PB值的计算方法同血清学PB值。应用IMAGE-PRO PLUS软件分析组织学hs-CRP和YKL-40的表达情况，计算染色阳性面积百分比。

2 结 果

2.1 血清学PB值及炎症因子水平与颈动脉狭窄程度的关系 轻度、中度、重度狭窄组间患者的年龄、BMI值，以及男性性别、各合并症、有吸烟史的占比的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。中度和重度狭窄组的TC水平均较轻度狭窄组显著增高(P值均<0.001)，重度狭窄组的TG较轻度和中度狭窄组显著增高(P=0.001、0.004)，重度狭窄组的HDL较中度狭窄组显著降低(P<0.05)。3组间血清学炎症因子水平、各病原微生物抗体的阳性率和PB值的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

2.2 血清学PB及炎症因子与CAP稳定性的关系

2.2.1 一般资料、血清学PB值及炎症因子比较 血清学稳定斑块组与不稳定斑块组一般资料比较的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。血清学不稳定斑块组HSV1 IgG阳性率、H.pyloriIgG阳性率、CPN IgG阳性率、PB值及YKL-40水平均显著高于稳定斑块组(P值均<0.01)；两组hs-CRP水平的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 不同狭窄程度的CAP患者的临床资料及血清学标志物的比较

与轻度狭窄组比较：①P<0.001。与中度狭窄组比较：②P<0.05

表2 不同斑块稳定性的CAP患者的临床资料及血清学标志物的比较

2.2.2 血清学标志物与CAP稳定性的相关性分析 Spearman 相关性分析结果显示，HSV1 IgG阳性、H.pyloriIgG阳性、CPN IgG阳性、PB值、YKL-40水平与CAP稳定性均呈正相关(P值均<0.01)；其中，血清学PB值和YKL-40水平与CAP稳定性的相关性较强(r=0.436、0.823)。见表3。

2.2.3 CAP稳定性的血清学多因素分析 校正混杂因素后，以CAP稳定性作为因变量进行二元有序logistic回归分析结果示， 不稳定斑块组血清学PB值和YKL-40水平增高均为CAP不稳定的独立危险因素。见表4。

表3 血清学标志物与CAP稳定性的相关性分析

表4 CAP稳定性的血清学指标的logistic回归分析

2.3 组织学PB值及炎症因子与CAP稳定性的相关性

2.3.1 一般资料、组织学PB值及炎症因子比较 组织学不稳定斑块组和稳定斑块组的一般资料比较的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。组织学不稳定斑块组H.pyloriIgG阳性率、CPN IgG阳性率、PB值均显著高于稳定斑块组,hs-CRP和YKL-40染色阳性面积均显著大于稳定斑块组(P值均<0.05或0.001)。见表5和图1、2。

表5 不同斑块稳定性CAP患者临床资料及组织学标志物比较

A 稳定斑块组 B 不稳定斑块组图1 CAP的hs-CRP免疫组织化学染色(脂质池右侧细胞呈棕黄色阳性反应)示意图(×200)

A 稳定斑块组 B 不稳定斑块组图2 CAP的YKL-40免疫组织化学染色(斑块基底部细胞呈棕黄色阳性反应)示意图(×200)

2.3.2 组织学标志物与CAP稳定性的相关

性分析 Spearman相关性分析结果显示，H.pyloriIgG阳性率、CPN IgG阳性率、PB值、hs-CRP和YKL-40阳性染色面积与CAP稳定性呈正相关(P值均<0.05)；其中，组织学hs-CRP和YKL-40阳性染色面积与CAP稳定性的相关性较强(r=0.509、 0.809)。见表6。

表6 组织学标志物与CAP稳定性的相关性分析

2.3.3 CAP稳定性的组织学多因素分析 校正混杂因素后，以CAP稳定性作为因变量进行二元有序logistic回归分析结果示，不稳定斑块组组织学YKL-40阳性染色面积为CAP不稳定的独立影响因素。见表7。

表7 CAP稳定性的组织学指标logistic回归分析

3 讨 论

据2021年发布的全球疾病负担(global burden of disease, GBD)研究[7]统计，脑卒中是造成我国老年人寿命年损失的第1位病因，且发病率以每年8.7%的速率上升。流行病学研究[5]显示，约30%～50%的缺血性卒中由不稳定CAP脱落导致颅内栓塞引起。不稳定斑块又被称为“易损斑块”,其最主要的病理特征为含较大的坏死核心，表面附以较薄的纤维帽(厚度<65 μm)，伴单核细胞、巨噬细胞浸润及炎症活动，血管内皮损伤及表面血小板聚集，斑块内破裂出血合并继发性血栓形成和狭窄。研究[2]显示，除高血压、高脂血症、吸烟、糖尿病、高同型半胱氨酸血症等传统高危因素外，急、慢性感染及其相关的炎症反应也是影响动脉粥样硬化及其斑块稳定性的重要因素。常见的病原微生物包括H.pylori、CPN、EBV、HSV-1、HSV-2和CMV。近年来，口腔和胃肠道病原微生物区系也成了研究热点[8]。北曼哈顿研究(Northern Manhattan study, NOMAS)和福冈动脉粥样硬化试验(Fukuoka Harasanshin atherosclerosis trial, FHAT)等大型临床试验证实，在其他高危因素基本相同的情况下，H.pylori感染与缺血性脑卒中的发生密切相关；也有研究者在发生脑卒中患者的颈动脉和颅内动脉壁上检测到CPN，提示其与颈动脉粥样硬化和缺血性脑卒中可能相关[9]。

关于感染影响CAP稳定性的潜在机制如下。①直接影响。病原微生物以间歇性、隐匿性或顿挫性的方式直接感染血管内皮细胞，或先感染血液中的单核细胞再进入血管壁后转化为巨噬细胞，促进各种炎症反应的发生，降低斑块稳定性。表现为短暂性菌血症后易损斑块破裂，从而发生临床事件。Smeeth等[10]对19 063例首次发作脑卒中患者的调查研究结果显示，在诊断为呼吸道感染或尿路感染后的第1天内，患者新发脑卒中的风险最高，而在病程的随后几周风险逐步降低。②间接影响。感染诱导的训练性免疫(trained immunity)反应亦是CAP形成的重要机制之一，单核或巨噬细胞在受到病原体或其产物的短暂刺激后，可促使机体形成一种全身性、持久性的过度激活状态，增加CAP进展风险[11]。

人体内可同时存在多种病原微生物的感染，或在感染后发生免疫炎症反应，因此急需一项指标，从整体角度评估感染对CAP的影响及其预后。PB概念的提出，为探讨感染和炎症反应对CAP稳定性的影响作用提供了新的视角。既往研究[12-13]发现，冠状动脉斑块的组织学PB值越高，斑块稳定性越差，发生ACS的风险越高，而血清学和组织学PB值与CAP稳定性的相关性尚存争议。此外，不同地域人群常见的病原微生物感染的种类和比例存在较大差异。例如，中国人群的病原微生物感染以H.pylori为主，现症感染率高达64%，显著高于欧美国家[14]。经笔者临床实践和分析发现，国内众多CAP患者的临床特点与国外报道的结果存在一定差异，主要表现：部分患者无传统动脉粥样硬化的高危因素，但症状性、闭塞性、多支多处合并性病变的比例却更高[15]，因此亟待探究中国人群PB值与CAP稳定性之间的相关性。本研究结果显示，不稳定斑块组血清学HSV1、H.pylori和CPN的IgG阳性率，以及组织学H.pylori和CPN 的IgG阳性率显著增高，且血清学PB值与CAP稳定性独立相关。本研究初步证实了中国人群病原微生物感染与CAP稳定性之间的相关性，并发现H.pyloriIgG阳性也与CAP稳定性显著相关，揭示了中国人群CAP病变特点不同于国外的可能原因。未来临床遇到无传统高危因素的CAP患者，可行血清学病原微生物抗体检测并计算PB值，若PB值较高，则需警惕斑块存在不稳定风险并予以预防性治疗。

近年来，hs-CRP和YKL-40是研究感染及炎症反应与CAP稳定性关系的热点因子。hs-CRP为经肝脏合成的一种非特异性炎症标志物，感染、炎症、组织损伤或自身免疫反应均可引起其水平升高。Gu等[16]的中介分析证实，血清学hs-CRP水平可能是缺血性卒中和CAP稳定性的独立预测指标，但其准确性和特异性有待进一步探讨。YKL-40又名几丁质酶3样1蛋白(chitinase-3-like-1 protein)，是一个相对分子质量为40 000 Da的肝磷脂和壳质链接的凝集素，属于哺乳动物甲壳质酶样蛋白家族，但无甲壳质酶活性。YKL-40作为一种新发现的炎症标志物，已被初步证实在巨噬细胞活化、组织重构和血管再生中发挥一定作用。笔者前期研究[17-18]发现，H.pylori感染致CAP的模型小鼠的YKL-40水平显著增高，提示其具有评估CAP稳定性的潜在价值。Wang等[19]检测了1 132例CAP患者血管超声检查结果及血清学YKL-40水平，发现YKL-40水平的高低与超声确定的CAP不稳定性显著相关。本研究通过多因素分析证实，血清学及组织学YKL-40 水平为影响CAP稳定性的独立危险因素，高表达患者存在更高的斑块不稳定风险。

本研究尚存一些局限。首先，基于单中心回顾性横断面研究设计，本研究样本量有限，其结论有待多中心、更大样本量的研究确证。其次，受限于检测条件，本研究仅选择常见病原微生物，没有检测更多种类的病原微生物感染情况，故数据的全面性有待完善。最后，本研究仅检测了相关病原微生物的血清学和组织学抗体水平，没有检测核酸表达情况，因此仅获得了既往感染的间接证据，尚未获得当前感染的直接证据。

综上，本研究从血清学和斑块组织学角度初步阐明了PB值及炎症因子与国人CAP稳定性之间的相关性，血清学PB值、血清学及组织学YKL-40水平是影响CAP稳定性的独立危险因素。因此，PB和YKL-40有望成为预测、评估CAP稳定性的潜在靶标。