免疫状态量化评估体系指导肝移植术后个体化免疫抑制药管理的临床应用探讨

贾亚男 朱继巧 李瀚 许文犁 王若麟 吕少诚 寇建涛 李先亮 贺强

肝移植术后免疫抑制药长期应用可导致相关不良反应，例如免疫抑制不足可诱发排斥反应[1-4]，免疫抑制过度则引起机会性感染、代谢性疾病和肿瘤等并发症[5]，上述术后并发症是影响移植受者长期存活的关键[6]。免疫抑制药通过抑制免疫细胞功能发挥保护移植器官的作用，由于缺少对免疫细胞功能状态进行评估的体系，临床上单纯依据血药浓度和肝功能指标来调整免疫抑制药的用量[7]，缺乏个体化方案[8]。很多移植中心的药物管理基于经验性用药和没有免疫细胞功能评估指导的盲减方案，由于存在个体药物代谢和免疫细胞功能状态的差异，很难做到精准的个体化管理。首都医科大学附属北京朝阳医院根据针对免疫系统的研究结果，结合实验室淋巴细胞亚群检测方法，开发出铭道免疫细胞状态全面评估体系（MingDao Immune Cell Analysis，MICA）和铭道免疫状态量化评分标准（MingDao Immune System Score，MISS）[9-10]，成功应用于临床指导肝移植术后免疫抑制药的管理，取得了一定成效，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2017年8月至2020年1月于首都医科大学附属北京朝阳医院肝胆胰脾外科门诊定期随访的239例肝移植受者的临床资料。根据免疫抑制药的调整方法将受者分为两组，其中用MISS评分调整免疫抑制药用药方案的为MISS评分组（84例）；同期按经验性用药调整用药方案的为常规对照组（155例）。MISS评分组，男69例，女15例，年龄（52±12）岁，原发病包括肝炎后肝硬化44例、酒精性肝硬化8例、自身免疫性肝硬化3例、原发性胆汁型肝硬化2例、药物性肝损害1例、布-加综合征1例、肝细胞癌22例、胆管细胞癌3例，随访时间（24±15）个月；常规对照组，男125例，女30例，年龄（52±9）岁，原发病包括肝炎后肝硬化67例、酒精性肝硬化10例、自身免疫性肝硬化1例、原发性胆汁型肝硬化1例、药物性肝损害1例、肝内胆管结石1例、肝细胞癌71例、胆管细胞癌3例，随访时间（26±16）个月。两组受者的性别、年龄、随访时间、原发病种类之间差异无统计学意义（P＞0.05）。MISS评分组84例受者共检测201例次，根据术后检测时间（t）将受者分为A组（t≤28 d，78例次）、B组（28 d＜t≤6个月，68例次）、C组（6 个月＜t≤12 个月，18例次）、D组（12 个月＜t≤24 个月，18例次）和E组（t＞24 个月，19例次）。本研究随访日期截止至2020年7月，主要随访终点为研究时间终点，如出现受者死亡或移植物功能丧失，停止随访。本研究中所有受者均签署了书面知情同意书，研究方案得到首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会批准。

纳入标准：（1）本中心成年同种异体全肝移植受者；（2）未参加其他临床试验。排除标准：（1）依从性差的受者；（2）超米兰标准肝癌肝移植受者；（3）既往有其他部位肿瘤史者。

1.2 手术方式及免疫抑制方案的调整

受者均采用改良背驮式原位肝移植术，术中开放前常规给予甲泼尼龙500 mg静脉滴注，免疫诱导药采用巴利昔单抗或猪抗人T细胞免疫球蛋白。术后糖皮质激素（激素）予以快速递减，采用他克莫司单药，或联合吗替麦考酚酯、西罗莫司的免疫抑制方案。

常规对照组根据受者肝移植术后血药浓度和肝功能指标调整免疫抑制药。MISS评分组在上述基础上根据免疫评分进行个体化调控：（1）若受者术前MISS评分＜-10分，提示免疫状态比较差，术后起始考虑给予低剂量他克莫司；若MISS评分＞0分，提示免疫状态激活，术后早期给足量钙调磷酸酶抑制剂；若MISS评分＞-10分且＜0分，则给予常规剂量他克莫司。（2）术后7 d，免疫状态MISS评分维持在-10分左右，MISS评分＜-15分考虑免疫抑制过度，可以适当减少剂量，MISS评分＞-5分则考虑免疫抑制不足，需及时增加他克莫司浓度和剂量。（3）术后1个月，MISS评分维持在-5分左右，避免MISS评分快速增高的情况发生。（4）术后3～6个月，MISS评分维持在-5～0分。（5）术后6个月以上， MISS评分维持在0分左右。

1.3 免疫状态检测方法和评分方法

免疫细胞功能状态检测方法：分别于术前、术后1个月以及此后约每3～6个月抽血检测和评估受者的免疫细胞功能状态，根据免疫细胞功能状态结果，进行药物剂量调整。

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管采集外周静脉血，常温保存，6 h内送达实验室。先进行密度梯度离心提取外周单个核细胞，EDTA磷酸盐缓冲液稀释，计数后调整细胞浓度备荧光染色用。淋巴细胞亚群分组染色，每组荧光以3～4种为佳。

加入表面抗体染色[荧光素标记的抗体如异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-CD3、多甲藻叶绿素蛋白-花青素（peridinin chlorophyll protein-cyanine 5.5，PerCP-Cy5.5）-CD4、PerCPCy5.5-CD8，藻红蛋白（phycoerythrin，PE）-CD19、PerCP-Cy5.5-CD20、别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）-CD16、PE-CD56、PE-CD4、FITC-Lineage（Lin1）（CD3、CD14、 CD16、CD19、CD20、CD56）、PerCP-Cy5.5-CD123、APC-CD11C均购于美国BD Bioscience公司]，最后用BDCantonⅡ流式细胞仪检测。每个细胞亚群染色不能超过4种荧光颜色，确保其荧光补偿精准，细胞亚群能够充分分别开来。进行流式细胞仪分析的时候，主要细胞亚群具体设门如图1所示。

图1 MICA分析方法中主要淋巴细胞亚群流式分析门设置Figure 1 Flow cytometry gate settings for main lymphocyte subsets in MICA analysis

免疫细胞功能评分方法：MICA分析时检测T淋巴细胞、T辅助或诱导淋巴细胞、T抑制或毒性淋巴细胞、T辅助或诱导淋巴细胞与T抑制或毒性淋巴细胞比例、调节性T淋巴细胞/效应性T淋巴细胞、自然杀伤T（natural killer T，NKT）细胞、浆细胞源性树突状细胞（dendritic cell，DC）、髓源性DC等30种淋巴细胞亚群的绝对值和相对值数据[9]。具体数据显示方案扫描二维码1可见。

扫描二维码1可见具体数据显示方案

同时依据免疫系统阴阳平衡的原则，建立MISS免疫评分体系（图2，具体评分方法申请国家专利中），分别赋予这些淋巴细胞亚群不同的权重，MISS=∑（L×W），其中L代表每个淋巴细胞亚群，W为该亚群的免疫评分权重，MISS评分标尺为-25～25分，其中正常免疫评分为0分，代表免疫平衡状态。负分为免疫降低状态，免疫功能受到抑制。正分为免疫功能激活状态，容易出现免疫攻击。

图2 MISS免疫评分尺Figure 2 MISS immune scale

该评分体系涵盖了免疫细胞绝对值数量、亚群比例、细胞表型、细胞间相互作用机制、细胞亚群的功能以及细胞亚群间代偿平衡的分析，因此能够更精准地体现整体的免疫细胞功能状态。类似于血气分析的价值，不仅能了解免疫的评分，同时也能够了解评分产生的细胞间的作用规律，可以指导具体的免疫细胞功能状态管理方案。

1.4 肝移植术后急性排斥反应和机会性感染的诊断

对于肝移植术后出现发热、黄疸等症状，血清总胆红素、转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶异常升高等，行B超引导下肝穿刺活组织检查。病理学诊断标准：（1）汇管区炎症细胞浸润，包括淋巴母细胞或活化的淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞；（2）门静脉或中央静脉内皮细胞下炎症；（3）胆管的炎症和损伤。如果不能完成肝穿刺的患者，有明确的临床表现、提高免疫抑制药浓度或者常规冲击治疗能够使移植肝功能恢复正常，考虑为临床急性排斥反应。肝移植术后机会性感染定义为确诊假丝酵母、伊氏肺孢子菌、巨细胞病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒感染。

1.5 研究内容

分析MISS评分组受者术后MISS评分情况，比较两组受者急性排斥反应和机会性感染的发生情况，分析两组受者总体生存率。

1.6 统计学方法

采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，比较采用t检验；非正态分布的计量资料采用中位数（下四分位数，上四分位数）表示，比较采用秩和检验；计数资料以率表示，比较采用χ2检验。应用Kaplan-Meier法计算并绘制生存曲线，组间生存差异比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MISS评分组受者术后MISS评分情况

在MISS评分组中，A～E组的MISS评分分别为 -7.0（-13.2，-2.0） 分、-2.0（-5.8，1.8） 分、-0.5（-7.3，2.8）分、-2.0（-4.5，3.3）分、-3.0（-6.0，1.0）分，受者的免疫状态随术后时间的延长而逐渐改善，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 两组受者术后急性排斥反应发生情况

截止至随访日期，MISS评分组受者中有15%（13/84）发生急性排斥反应，常规对照组受者中有27%（42/155）发生急性排斥反应，差异有统计学意义（P＜0.05）。

MISS评分组受者中13例发生急性排斥反应，71例未发生急性排斥反应，发生急性排斥反应与未发生急性排斥反应的受者性别、年龄、随访时间、原发疾病种类之间差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。MISS评分组中发生急性排斥反应的受者他克莫司血药浓度7.0（5.5，8.6）ng/mL，未发生急性排斥反应的受者他克莫司血药浓度5.9（3.3，9.4）ng/mL，差异无统计学意义（P＞0.05）。发生急性排斥反应的受者MISS评分为0（-2.5，3.5）分，未发生急性排斥反应的受者为-5.0（-12.0，-1.0）分，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明显著提高的免疫状态和急性排斥反应发生相关。

2.3 两组受者术后机会性感染发生情况

截止至随访日期，MISS评分组受者中有2%（2/84）发生术后机会性感染，常规对照组受者中有9%（14/155）发生术后机会性感染，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 两组受者的总体生存率

截止至随访日期，MISS评分组受者1年、3年总体生存率分别为86.9%、79.8%，常规对照组分别为83.2%、76.8%（图3），MISS评分组生存率下降略慢于常规组，但两组受者术后总体生存率差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 两组受者总体生存率比较Figure 3 Comparison of the overall survival rate of the recipients between two groups

3 讨 论

免疫抑制药的长期应用带来诸如慢性排斥反应、感染、肿瘤复发等不良反应，是影响移植肝长期存活的关键因素之一[11-14]。目前免疫抑制药种类选择比较多，每个移植中心也都有独特的经验性用药方案。但在临床工作中发现，由于个体药物代谢的不同，以及免疫状态个体差异化表现，还是有很多患者需要更加个体化的免疫抑制方案[15-16]。免疫抑制药可抑制淋巴细胞的激活[17]，进而保护肝脏不受免疫攻击，但是免疫抑制药的调节窗口比较窄[18]，目前对免疫细胞状态进行评估的体系较为缺乏。

研究提示，T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、DC等淋巴细胞亚群都会不同程度地参与移植物排斥反应过程[19-21]，因此通过测定淋巴细胞及其亚群全面评估受者的免疫细胞功能状态进行有效的免疫监测是可行的[22-24]，但是单个数据不能反映整体的免疫细胞功能状态，很难有效指导药物管理。国内外关于肝移植术后的免疫监测手段始终没有形成标准体系，也并未得到业界的普遍应用，笔者所在中心根据过去十年研发结果，结合实验室的流式细胞仪检测技术，探索开发出了MICA和MISS免疫细胞功能评估体系，用于肝移植受者整体免疫细胞功能状态的评估，并成功应用于临床工作中。

本研究数据提示，肝移植受者因术中及术后早期大量激素和免疫抑制药的使用，导致淋巴细胞亚群数量和功能受到显著影响，从而MISS免疫评分迅速下降，在术后1个月内达到最低点，此后随着受者病情逐渐恢复和稳定，免疫抑制药的剂量逐渐减少，到术后6个月时，由于免疫细胞功能状态的恢复，免疫评分逐渐上升，符合术后免疫细胞功能状态恢复的一般规律，也和临床用药规律趋势相似。

术后免疫过度抑制增加了感染、肿瘤复发的风险[25-27]，MISS评分能够有效判断受者免疫状态，平衡免疫系统和移植物保护之间的关系。在本研究中，笔者根据免疫评分进行免疫抑制药管理，若出现了MISS评分短期内显著升高，或者在肝移植术后1个月内MISS评分持续升高，提示机体免疫系统处于激活状态，针对移植物的攻击性增强，可能会发生急性排斥反应。因此MISS评分在肝移植术后早期是一个良好的预测急性排斥反应的指标。根据MISS评分，即使肝功能处于正常状态，药物浓度合理，也有必要提前增加药物剂量，或调整联合用药，预防排斥反应发生。笔者观察到临床急性排斥反应受者的MISS评分的提高，会在2～3 d前早于肝功能酶学指标升高，具有很好的预测性，可以防止临床排斥反应发生[9]。若出现了严重MISS评分降低，比如在术后早期（1个月内）＜-15分，或者长期存活（6个月以上）的受者MISS评分＜-5分，都提示免疫抑制过度，应及时降低免疫抑制药剂量或浓度，避免机会性感染的发生。本研究结果提示，在应用MISS评分指导免疫抑制方案的受者中，不仅急性排斥反应的发生率低于根据经验用药受者，而且其罹患机会性感染的概率也低于根据经验用药受者。

在MISS评分组的亚组分析中，免疫抑制药的血药浓度并无明显差别，提示相似免疫抑制药血药浓度情况下，机体免疫状态恢复程度可以不同，因此不能完全依赖血药浓度预防急性排斥反应，需要更直观的细胞水平的免疫监测。笔者早期数据也提示，群体的免疫抑制药血药浓度和免疫状态之间不存在线性相关联系[9]，但是针对特定个体，免疫抑制药的增减可以直接影响个体免疫状态[28-29]。当MISS评分显著降低时，提示免疫抑制过度，可以适当地减少药物剂量，预防机会感染的发生。对于术前就存在显著降低的MISS评分者，术后直接给予最小剂量免疫抑制药，不考虑指南推荐的血药浓度水平，可以更好地帮助受者度过术后早期危险阶段。因此我们术后免疫药物剂量的管理依赖于免疫细胞功能状态的监测，而不仅仅考虑其血药浓度。

通过对比MISS评分组和常规对照组远期生存率发现，虽然两组间总体生存率差异无统计学意义，但MISS评分组生存率下降略慢于常规对照组，因此值得我们进一步探讨和研究。这也可能与本评估手段应用时间短、长期观察病例数不足有关，相信经过长期或者更大规模的临床多中心试验应用，MICA免疫细胞功能状态评估方法和MISS评分体系能够优化术后免疫水平管理，推动免疫抑制药管理的精准个体化发展。