改良Carba Np试验和mCIM/eCIM快速鉴定产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌表型的临床应用

包海林， 花鸿燕， 孙恒亮， 刘 华， 吉顺年， 秦陈浩， 杜 鸿

（1.海安市中医院检验科，江苏 海安 226600；2.苏州大学附属第二医院微生物科，江苏 苏州 215004）

Carba NP试验和改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）是美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）先后推荐的用于检测和鉴别肠杆菌科细菌、非发酵菌碳青霉烯酶的确证试验，CLSI推荐联合乙二胺四乙酸碳青霉烯酶灭活试验（ethylenediaminetetraacetic acid-carbapenem inactivation method，eCIM）用于产酶肠杆菌科细菌的检测和酶型分析[1]。Carba NP试验检测低水解活性的碳青霉烯酶OXA-48时敏感性较低，仅为55.7%～70.9%[2]，且操作相对复杂，影响因素偏多。mCIM/eCIM需孵育2次，且美罗培南纸片在待测菌悬液中浸泡4 h，易因纸片总药物含量降低而致假阳性，不能达到快速检测的目的[3]。本研究通过改良Carba NP试验，分别采用他唑巴坦和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）作为A和B类酶抑制剂，以区分A、B、D类酶，将mCIM/eCIM的2次孵育时间分别缩短至2和9 h，探讨2种改良方法在检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集2019年12月—2020年9月海安市中医院临床分离的非重复肠杆菌科细菌136株，其中耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem resistantEnterobacteriaceae，CRE）86株[亚胺培南或美罗培南最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 μg/mL]，碳青霉烯类敏感菌株50株（亚胺培南、美罗培南均敏感）。标准菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1705）和肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1706）均购自我国国家卫生健康委临床检验中心。

1.2 主要仪器与试剂

VITECK 2 Compact自动化鉴定药敏仪及配套鉴定药敏卡板（法国生物梅里埃公司），ALL SHENG Auto-Pure 96磁珠法核酸提取仪（杭州奥盛公司），C1000 Thermal cycler PCR扩增仪、Gel Doc XR+凝胶成像仪（美国伯乐公司），CP-31DN电泳仪（北京六一公司），血平板、MH琼脂平板和亚胺培南西司他丁（美国默沙东制药有限公司），胰酪蛋白大豆肉汤培养基[（tryptic soy broth，TSB），杭州百思生物技术有限公司]，10 μg美罗培南药敏纸片（温州康泰生物技术有限公司），DNA mark D2000，2×Taq master mix[生工生物工程（上海）有限公司]，MagMax-96DNA Multi-Sample Kit（美国ThermoFisher Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 改良Carba NP试验 在37 ℃培养24 h的MH平板上用1 μL接种环挑取1满环受试菌株，加入装有100 μL细菌总蛋白抽提液（Tris-HCl，20 mmol/L）的eppendorf管中，剧烈振荡30 s，分装于5个管，分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，每管底物成分见表1；将pH值调至7.8±0.1，37 ℃孵育2 h。如菌株产碳青霉烯酶，会水解亚胺培南西司他丁，并释放H+，使pH值降低，酚红指示剂变色（红变黄）；反之指示剂不变色。他唑巴坦管（Ⅲ）不变色为A类酶， EDTA管（Ⅳ)不变色为B类酶，2个管均变色 （Ⅴ）为D类酶。阳性对照菌株为肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1705），阴性对照菌株为肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1706）。

表1 改良Carba NP试验底物成分

1.3.2 mCIM/eCIM试验 制备2管TSB肉汤（2 mL），其中1管含EDTA（终浓度为5 mmol/L）。用1 μL接种环刮取1满环于血平板培养24 h的待测菌，分别加入含2 mL TSB肉汤的eppendorf管中，振荡混匀。将美罗培南药敏纸片（10 μg）浸入菌液中，35 ℃温育2 h，制备成0.5麦氏浊度的大肠埃希菌（ATCC 25922）悬液，均匀涂布在MH琼脂平板上，反扣平板干燥5 min。用10 μL接种环将美罗培南纸片贴于试管内壁，去除多余菌液后取出，再贴到同一MH琼脂平板上。35 ℃温箱孵育9 h，测量抑菌圈直径。结果判断：（1）美罗培南药敏纸片的抑菌圈直径为6～15 mm，或直径为16～18 mm但抑菌圈内有散在菌落，判定为产碳青霉烯酶菌株；抑菌圈直径≥19 mm为阴性；（2）mCIM阳性和eCIM抑菌圈直径的差值≥5 mm，判定为产金属酶；若差值≤4 mm，判定为产丝氨酸酶。mCIM阴性时，eCIM无需再判断；eCIM抑菌圈内散在的针尖样菌落可以忽略不计。阳性对照菌株为肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1705），阴性对照菌株为肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1706）。

1.3.3 碳青霉烯酶基因扩增与检测 采用磁珠法提取待测菌基因组DNA，按试剂盒说明书要求操作。参照文献[4-5]设计碳青霉烯酶基因bla、bla、bla、bla和bla[2]引kpc-2NDM-1IMP-4VIM-1OXA-48物（表2）。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增体系：上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq master mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s；56 ℃退火60 s；72 ℃ 5 min，32个循环。用1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物后，用凝胶成像仪拍照。

表2 PCR引物序列及目的片段长度

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计数资料用例或率表示，比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 耐药基因检测结果

86株CRE菌株中，有81株检出碳青霉烯酶基因，其中43株携带blakpc-2，32株携带blaNDM-1，4株携带blaIMP-4，2株共同携带blakpc-2和blaNDM-1基因；5株未检出耐药基因。有53株肺炎克雷伯菌检出耐药基因，其中39株携带blakpc-2基因，9株携带blaNDM-1，3株携带blaIMP-4，2株同时携带blakpc-2和blaNDM-1。有20株大肠埃希菌耐药基因阳性，其中18株携带blaNDM-1，2株携带blakpc-2。50株碳青霉烯敏感肠杆菌科细菌均未检出耐药基因。见图1、图2、图3。

图1 blakpc-2基因电泳结果

图2 blaNDM-1基因电泳结果

图3 blaIMP-4基因电泳结果

2.2 2种方法碳青霉烯酶表型筛查结果

86株CRE中，改良Carba NP试验阳性82株，阴性4株；mCIM阳性78株，阴性8株。改良Carba NP试验与mCIM阳性检出率差异无统计学意义（χ2=1.65，P＞0.05）。eCIM阳性36株，阴性42株（有8株mCIM阴性，eCIM无需解释结果）。50株碳青霉烯类敏感菌株中，改良Carba NP试验、mCIM/eCIM均阴性。43株A类碳青霉烯酶基因阳性菌株中，改良Carba NP试验阳性42株，阴性1株；mCIM阳性41株，阴性2株；eCIM阳性3株，阴性38株，无效2株。36株B类碳青霉烯酶基因阳性菌株中，改良Carba NP试验、mCIM均为阳性，3株eCIM阴性。2株同时携带blakpc-2和blaNDM-1的菌株改良Carba NP试验、mCIM/eCIM均为阴性。部分CRE菌株改良Carba NP试验结果见图4。部分菌株mCIM/eCIM结果见图5。基因检测和表型筛查结果见表3。

图4 部分CRE改良Carba NP试验结果

图5 部分菌株mCIM/eCIM碳青霉烯酶表型筛查结果

表3 2种方法基因检测和表型筛查结果

2.3 改良Carba NP试验和mCIM检测CRE的效能

改良Carba NP试验和mCIM检测CRE的敏感性分别为96.3%和91.4%，特异性均为92.7%，与PCR检测结果的一致性均较高。见表4。

表4 改良Carba NP试验和mCIM表型检测结果比较

2.4 改良Carba NP试验碳青霉烯酶分型检测效能

82株改良Carba NP试验阳性菌株中，42株（97.7%）检出A类碳青霉烯酶，36株（43.9%）检出B类碳青霉烯酶菌株。见表5。

表5 改良Carba NP试验与PCR分型结果比较

2.5 eCIM检测金属碳青霉烯酶的效能

eCIM检测金属碳青霉烯酶的敏感性和特异性分别为91.2%和90.4%，检测丝氨酸碳青霉烯酶的敏感性和特异性分别为93.0%和94.3%。与PCR结果一致性较好（kappa值＞0.75）。见表6。

表6 eCIM与PCR检测结果比较

3 讨论

随着碳青霉烯类抗菌药物在治疗肠杆菌科细菌感染性疾病中的应用，CRE的检出率逐年上升[6]。碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌感染导致的死亡患者例数增加得最多[7]。有研究结果显示，肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为26.6%和27.2%[6]。目前，临床判断细菌是否对碳青霉烯耐药主要依靠体外药物敏感性试验结果，但一些CRE的MIC可能低于美国临床实验室标准化协会或欧洲抗菌药物敏感性试验委员会确定的耐药折点，主要原因是一些产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物的水解能力较弱，导致体外试验结果为敏感的菌株实际临床表现为耐药；同时，抗菌药物对不同产酶类型菌株的治疗效果有很大区别[8]。因此，鉴别菌株产酶类型非常重要。

目前，碳青霉烯酶的检测方法通常为表型检测、实时荧光定量PCR或多重PCR、二代测序等。表型检测简便、快捷，其中Carba NP试验和mCIM是有望在临床微生物学实验室推广使用的2种方法，但存在某些碳青霉烯酶表型检测敏感性差、耗时长、不利于临床常规开展等缺点。本研究在Carba NP试验的基础上，分别增加了他唑巴坦和EDTA作为A类和B类碳青霉烯酶抑制剂，以此来区分A、B、D类酶。若含亚胺培南西司他丁管变色即为阳性；含他唑巴坦管不变色即为产A类酶菌株，含EDTA管不变色即为产B类酶菌株，含他唑巴坦和EDTA管都变色即为产D类酶菌株。值得注意的是，Carba NP试验的原理是利用细菌产碳青霉烯酶水解亚胺培南产生H+，使pH值下降，指示剂变色，所以pH值必须调节在7.8±0.1才能灵敏地发生颜色变化。

本研究结果显示，改良Carba NP试验检测CRE的敏感性为96.3%、特异性为92.7%，与PCR结果一致性较好。有研究发现，黏液性菌株可致Carba NP试验假阴性[9]。本研究中，有3株肺炎克雷伯菌改良Carba NP试验假阴性，这3株肺炎克雷伯菌均为黏液性菌株。本研究结果显示，改良Carba NP试验对于单独携带blakpc-2基因或blaIMP-4基因的菌株比较敏感，而对于同时携带这2种基因的菌株敏感性较差。总体来看，改良Carba NP试验可以快速地为临床提供产酶菌株的分型结果。

本研究将mCIM孵育时间由4 h缩短至2 h，将美罗培南纸片转种至MH平板孵育时间缩短至9 h，结果显示，mCIM检测碳青霉烯酶的敏感性为92.6%，特异性为94.5%，与PCR结果一致性较高。本研究结果显示，基因检测为阳性的菌株中有2株大肠埃希菌和2株弗劳地枸橼酸杆菌mCIM结果为阴性，可能与美罗培南纸片孵育时间或MH平板孵育时间过短、碳青霉烯酶阳性菌株酶释放过少，或药物敏感性试验中菌株培养时间过短导致的假阴性有关，后续将调整孵育时间，改进试验方法；有2株碳青霉烯类耐药大肠埃希菌基因检测和mCIM均阴性，可能与其耐药机制[10]有关；改良Carba NP试验假阴性的3株肺炎克雷伯菌mCIM阳性，mCIM假阴性的2株大肠埃希菌和2株弗劳地枸橼酸杆菌改良Carba NP试验阳性，原因可能为eCIM利用EDTA抑制金属酶来区分产金属酶和丝氨酸酶的耐药菌株，而本研究eCIM筛选金属碳青霉烯酶的敏感性为91.2%，特异性为90.4%，低于相关研究[11-13]结果，可能与菌株数过少或孵育时间过短有关。有研究发现，eCIM检测结果亦与EDTA的浓度有关，EDTA浓度为30 mmol/L时，检测阳性率最高[14]。对于同时携带blakpc-2基因和blaIMP-4基因的菌株，mCIM无法鉴别。

有研究结果显示，第三代头孢菌素与新型β-内酰胺酶抑制剂复合剂，如头孢他啶-阿维巴坦，对产KPC酶和OXA-48酶CRE具有高度的抑制作用，但对产NDM类金属酶CRE则无效[15]。对于产金属酶的致病菌株，可采用氨曲南-阿维巴坦或头孢地尔治疗[16]。有研究结果显示，泛耐药肠杆菌科细菌仅对替加环素、多黏菌素和头孢他啶-阿维巴坦敏感[17]，因此应尽早开展耐碳青霉烯类细菌的表型检测和药物敏感性试验，为临床提供有效的治疗依据。

综上所述，改良Carba NP试验通过观察颜色变化判断结果，直观且可靠，可快速鉴定碳青霉烯酶表型；mCIM/eCIM也可在1 d内完成分型报告。2种改良方法可优势互补，提高分型准确率和效率，及时为临床用药提供参考。