AS患者sLAIR-1和LAIR-1 mRNA的表达及其与疾病活动度的关系

何亚亚， 陈闪闪， 李永胜， 刘 娟

（1.南京医科大学附属淮安市第一人民医院检验科，江苏 淮安 223300；2.南京医科大学附属淮安市第一人民医院风湿免疫科，江苏 淮安 223300）

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性、多系统的炎症性自身免疫性疾病，主要影响中轴关节[1]。有研究结果显示，AS的发病过程与T细胞功能障碍密切相关，AS患者外周血辅助性T细胞（T helper cell，Th）17占CD4+T细胞的比例显著增加[2]。此外，固有免疫活化在AS的发病机制中同样发挥着重要作用。来自肠道细菌的脂多糖可通过激活单核细胞和巨噬细胞上的Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）4显著增强人白细胞抗原B27（human leukocyte antigen B27，HLA-B27）未折叠蛋白诱发的细胞因子分泌能力。活化的巨噬细胞也促进了白细胞介素（interleukin，IL）-23的分泌和Th17细胞的激活。白细胞相关免疫球蛋白样受体-1（leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1，LAIR-1）是在多种免疫细胞上表达的免疫球蛋白超家族成员，可通过发挥免疫抑制功能维持T细胞和巨噬细胞等免疫细胞的平衡[3]。LAIR-1可在多种自身免疫性疾病中异常表达，但在AS中是否存在表达异常尚未见相关报道。为此，本研究拟分析血清可溶性白细胞相关免疫球蛋白样受体-1（soluble leukocyte-associated immunoglobulinlike receptor-1，sLAIR-1）和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中LAIR-1 mRNA表达的变化，及其与AS患者疾病活动度之间的关系；并分析sLAIR-1和LAIR-1 mRNA在抗肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）生物制剂英孚利昔单抗治疗前后的变化，探讨将其定为AS生物标志物的可能性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2020年9月—2021年6月南京医科大学附属淮安市第一人民医院AS患者81例（AS组），其中男67例、女14例，年龄（32.58±12.94）岁。AS诊断依据国际强直性脊柱炎协会（the Assessment of Spondyl Arthritis International Society，ASAS）2010年发布的诊断标准[4]。排除标准：合并冠心病、活动性感染、糖尿病、多囊卵巢综合征、肝脏疾病、肾脏疾病和肿瘤等。另选取南京医科大学附属淮安市第一人民医院健康体检者80名（正常对照组），其中男68名、女12名，年龄（31.98±9.65）岁。排除标准：有慢性系统性疾病、任何类型的自身免疫性疾病、感染或恶性肿瘤；有类固醇、细胞毒性药物和免疫抑制剂等用药史。2个组之间年龄和性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。收集81例AS患者中17例活动期患者英孚利昔单抗（西安杨森制药有限公司）治疗6周后的sLAIR-1和LAIR-1 mRNA检测结果，分析治疗前后LAIR-1水平的变化。本研究经南京医科大学附属淮安市第一人民医院伦理委员会审批，所有对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集所有对象的一般资料[年龄、性别、吸烟史、体质量指数（body mass index，BMI）等]。收集AS患者的详细病史资料[病程、治疗方案、强直性脊柱炎疾病活动评分（ankylosing spondylitis disease activity score，ASDAS）等]和入院后首次实验室检测结果[白细胞（white blood cell，WBC）计数、淋巴细胞绝对数（the absolute value of lymphocyte，LYMPH#）、中性粒细胞绝对数（the absolute value of neutrophil，NEUT#）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、血小板（platelet，PLT）计数、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和HLA-B27]。询问患者是否有炎症性背痛、骶髂关节炎，并评估其抗TNF-α治疗疗效。疾病活动指标包括晨僵的持续时间、医生的整体评估（0～10分）、患者的整体评估（0～10分）、ASDAS、CRP及关节压痛和肿胀计数。ASDAS是评价AS疾病活动度新的综合指标[5]，包括5项：（1）总体腰背痛程度；（2）患者总体评价；（3）外周关节疼痛肿胀程度；（4）晨僵持续时间；（5）ESR或CRP。ASDAS分为基于ESR（ASDAS-ESR）和基于CRP（ASDAS-CRP）2种评分方式，其中准确性更高的是ASDAS-CRP，计算公式为：ASDAS-CRP=0.12×腰背痛评分+0.06×晨僵持续时长+0.11×患者总体评价+0.07×外周关节肿胀/疼痛+0.58×ln（CRP+1）[6]。

1.2.2 样本采集 采集所有患者入院治疗前、正常对照者体检当日的清晨空腹静脉血6 mL，其中3 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，用于LAIR-1 mRNA检测；另外3 mL置于干燥管中，离心分离血清后，保存于-80 ℃冰箱，用于血清sLAIR-1、IL-6及IL-17检测。

1.2.3LAIR-1 mRNA检测 采用荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测LAIR-1 mRNA。取1.0 mL乙二胺四乙酸抗凝血，与等体积磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加入Ficoll淋巴细胞分离液，密度梯度离心（400×g离心30 min），收集的中间层细胞即为PBMC。采用Trizol试剂（美国ThermoFisher Scientific公司）提取PBMC总RNA，采用iScript cDNA Synthesis kit（美国伯乐公司）将RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Green PCR kit（美国伯乐公司）及ABI 7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）进行PCR扩增。反应条件：预变性95 ℃30 s，变性95 ℃ 5 s，40个循环；退火60 ℃30 s。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算LAIR-1 mRNA的相对表达量。严格按仪器和试剂盒说明书进行操作。 引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4 sLAIR-1、IL-6及IL-17检测 采用酶联免疫吸附试验检测血清sLAIR-1和IL-17水平，试剂盒购自美国R&D公司（货号分别为DY2664-05、D1700）。采用cobas e602全自动电化学发光分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂检测血清IL-6水平。严格按仪器和试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 活动期AS患者英孚利昔单抗治疗前后sLAIR-1和LAIR-1 mRNA的变化 从81例AS患者中选取17例活动期患者，均为男性，年龄（27.71±5.89）岁。采用抗肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）生物制剂英孚利昔单抗治疗6周。分析治疗前后sLAIR-1和LAIR-1 mRNA的变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析。呈非正态分布的计量资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。采用Spearman相关分析评估sLAIR-1、LAIR-1 mRNA与各项指标的相关性。AS患者英孚利昔单抗治疗前后各项指标比较采用配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS组和正常对照组临床资料比较

AS组病程为8.00（3.50～61.00）个月，医生整体评价为（5.35±2.04）分，患者整体评价为（6.28±2.11）分，晨僵时长为33（16～47）min，压痛关节数为（2.25±1.58）个，肿胀关节数为（2.18±1.93）个，ASDAS-CRP为（2.98±1.30）分。81例AS患者中，22例（27.16%）有家族史，36例（44.44%）伴外周关节累及，28例（34.57%）合并葡萄膜炎，14例（17.28%）合并肌腱炎。AS组WBC计数、LYMPH#、PLT计数、CRP和ESR高于正常对照组（P＜0.05），2个组之间BMI、吸烟史和NEUT#差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 AS组与正常对照组临床资料比较

2.2 AS组和正常对照组sLAIR-1、LAIR-1 mRNA 、IL-17及IL-6水平比较

AS组血清sLAIR-1、IL-17及IL-6水平显著高于正常对照组（P＜0.001），而LAIR-1 mRNA水平则显著低于正常对照组（P＜0.001）。见表3。

表3 AS组与正常对照组sLAIR-1、LAIR-1 mRNA 、IL-17及IL-6水平比较

2.3 AS患者sLAIR-1和LAIR-1 mRNA与各项指标之间的相关性

Spearman相关分析结果显示，sLAIR-1与IL-17、IL-6、CRP、ASDAS-CRP呈正相关（r值分别为0.482 4、0.475 3、0.391 6、0.565 7，P＜0.01），与LAIR-1 mRNA呈负相关（r=-0.446 6，P＜0.001）；LAIR-1 mRNA与IL-17、IL-6、CRP、ASDAS-CRP呈负相关（r值分别为-0.399 6、-0.227 8、-0.265 1、-0.366 8，P＜0.05）。sLAIR-1、LAIR-1 mRNA与WBC计数、LYMPH#、PLT计数及ESR均无相关性（P＞0.05）。

2.4 活动期AS患者采用英孚利昔单抗治疗前后sLAIR-1和LAIR-1 mRNA的变化

与治疗前比较，AS患者采用英孚利昔单抗治疗6周后，血清sLAIR-1水平显著下降（P=0.000 2），LAIR-1 mRNA水平显著升高（P=0.001 1）。见图1、图2。

图1 活动期AS患者英孚利昔单抗治疗前后血清sLAIR-1的变化

图2 活动期AS患者英孚利昔单抗治疗前后LAIR-1 mRNA的变化

3 讨论

LAIR-1属于免疫抑制性受体家族成员，可调节免疫系统平衡，防止免疫反应过度可能导致的组织损伤或自身免疫功能紊乱[7]。LAIR-1在大多数免疫细胞中均有表达，包括自然杀伤细胞、T细胞、B细胞、单核细胞和CD34+造血祖细胞[3]，LAIR-1活化已被证明可抑制此类免疫细胞的功能[8]。胶原蛋白是LAIR-1的功能性配体，在体外可直接抑制免疫细胞的激活。此外，LAIR-1还能识别具有胶原蛋白结构的蛋白质，如经典补体途径成分C1q[9]。LAIR-1交联会抑制T细胞受体介导的信号传递，B细胞产生IgG、IgE，自然杀伤细胞对靶细胞的裂解[10]。此外，LAIR-1交联和C1q刺激还可抑制浆细胞样树突状细胞释放α干扰素以及单核细胞经TLR9刺激后产生细胞因子[11-12]。在健康人和类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的血浆和尿液中均可检测到sLAIR-1。OLDE NORDKAMP等[13]的研究结果显示，RA患者尿液LAIR-1水平显著高于健康人（P＜0.001），并与炎症标志物ESR明显相关。过度表达LAIR-1可降低包括IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶-13在内的炎症因子的表达[14]。由此可见，LAIR-1在RA中主要发挥抗炎作用。RA患者CD4+T细胞LAIR-1水平下降，对T细胞激活的抑制不足，促进了自身免疫性疾病的进展[15]。在胶原蛋白的刺激下，CD4+T细胞LAIR-1表达明显上调，用刺激性LAIR-1单克隆抗体共培养时，CD4+T细胞分泌的IL-2、γ干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）和IL-17水平显著下降[15]。动物实验结果表明，用刺激性LAIR-1单克隆抗体治疗可减弱LAIR+/+小鼠由胶原蛋白诱发的关节炎[15]。本研究结果显示，AS患者sLAIR-1显著升高（与RA患者情况相同[16]），LAIR-1 mRNA则显著下降，并且这2种形式的LAIR-1与炎症因子均显著相关，与疾病活动度高度相关，提示sLAIR-1或能作为AS疾病活动度评价的潜在指标。

AS的发病机制目前尚不清楚，LAIR-1异常表达的原因可能是：（1）LAIR-1调控免疫细胞介导的炎症反应，可抑制IL-6、IL-17等促炎细胞因子的分泌，而LAIR-1mRNA表达下降可能会导致这种平衡被打破，促进AS发展；（2）AS特有的炎症微环境可显著改变LAIR-1的表达，异常变化的LAIR-1失去了调控功能，导致免疫失衡加剧。在未来的研究中，建议对AS动物模型给予LAIR-1的阻断型抗体或重组蛋白，抑制其表达，以验证其是否可以作为AS的治疗靶点。此外，本研究还发现，AS患者sLAIR-1显著上调，而LAIR-1 mRNA显著下降。LAIR-1 mRNA下降可能是由CD4+T细胞、CD8+T细胞和单核细胞等表面LAIR-1表达下调引起，这与先前在多种自身免疫性疾病中的研究结果[17-18]一致。sLAIR-1表达上调虽在RA中也有发现，但原因尚不清楚，推测可能是因为PBMC中呈游离状态的LAIR-1与非游离状态的LAIR-1竞争结合型配体，进一步削弱PBMC中非游离状态LAIR-1的免疫抑制信号和生物功能，加剧了炎症反应和免疫失衡。目前尚未见sLAIR-1是否可以同样发挥炎症抑制作用的相关报道。在下阶段的研究中，我们将利用LAIR-1刺激体外分离的AS患者的PBMC，分析细胞因子的分泌情况。另外，本研究发现，活动期AS患者经英孚利昔单抗治疗后，sLAIR-1水平显著下降，趋于正常化，但其中有3例患者治疗前后无差异，甚至有所上调。分析这3例患者的临床资料后发现，患者治疗后疾病活动度并无显著变化，推测可能是英孚利昔单抗治疗的耐受患者。

本研究还有一些不足之处：（1）纳入随访的病例相对较少，且未追踪1个完整疗程（30周）后LAIR-1的表达情况；（2）未研究AS患者炎症组织中LAIR-1的表达情况；（3）PBMC中LAIR-1 mRNA下调，但本研究未采用流式细胞术分析各细胞表面LAIR-1的表达情况；（4）未分析17例英孚利昔单抗治疗6周后患者LAIR-1表达水平与炎症指标和临床指标的相关性；（5）本研究为单中心前瞻性研究，结果尚需多中心大样本研究加以验证；（6）受限于治疗随访数，未分析sLAIR-1是否可作为预测英孚利昔单抗治疗反应性的标志物。

综上所述，LAIR-1水平与AS疾病活动度密切相关，提示其或可作为临床评估AS患者疾病活动度的辅助指标。本研究也为未来深入研究LAIR-1与AS发病机制的关系奠定了一定基础。