植物根际土壤真菌Trichoderma velutinum的化学成分研究

旷敏，彭伟伟，许立，郑雨婷，桑子焕，秦思雨，邹振兴*（1.中南大学湘雅药学院，长沙 410013；2.慢病诊疗小分子药物发现与转化湖南省重点实验室，长沙 410013）

微生物代谢是发现天然活性产物的一大重要途径，目前为止，从微生物天然产物中分离出的具有生物活性的化合物有1 万多种[1-2]。其中，植物根际土壤真菌因其强大的次生代谢能力、潜在的物种多样性及便于发酵和遗传等优势，逐渐成为继植物内生真菌之后研究者们关注的焦点。植物根际土壤真菌是指生存于植物根系活动区域的真菌，它们同植物根系紧密联系，又广泛参与土壤生态中营养物质的循环，其代谢途径独特，能够产生结构新颖、生物活性显著的次生代谢产物[3]。据统计，植物根际土壤真菌目前研究偏重于农业应用，其化学成分研究存在较大的探索空间[4-5]。

木霉属真菌是普遍存在于土壤中的一种常见植物根际微生物。在自然界中，木霉属真菌多通过化学途径帮助植物抵抗虫害，具有强大的代谢能力。目前，木霉属真菌已被发现数百种次生代谢产物，主要包括萜类、环肽类、二酮哌嗪类、生物碱类及聚酮类化合物，且大多具有较好的抗肿瘤、抗菌等药理活性[6-7]。现有研究表明，木霉属真菌能产生众多结构独特的活性分子，具有极大的挖掘价值。本研究前期从药用植物根际土壤样本中分离筛选出一株木霉属真菌Trichoderma velutinum，化学丰度筛选显示其代谢产物丰富，且经文献调研发现Trichoderma velutinum的次级代谢产物成分研究稀少，因此，有必要对其化学成分进行深入探索。将其进行大规模固体发酵并用乙酸乙酯冷浸提取发酵产物，利用各色谱层析手段进一步分离纯化获得13 个化合物，其中包括4 个细胞松弛素、6 个二酮哌嗪、1 个N-acetyltryptamine 和2 个腺苷类化合物。化学结构如图1 所示。

图1 化合物1 ～13 的结构Fig 1 Structures of compounds 1 ～13

1 材料

Agilent 1290 型高效液相色谱-Agilent 6500 series Q-TOF 质谱联用仪（美国安捷伦公司）；Bruker AV-400/AV-500/AV-600 型核磁共振仪（德国Bruker 公司）；Autopol IV-T 全自动旋光仪（美国鲁道夫公司）；X-6 熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司），安捷伦1100 半制备型液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；高压灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；ODS 反相C18填料（日本YMC 公司）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶（美国GE 公司）；柱色谱硅胶（80 ～100 目、200 ～300 目、300 ～400 目，青岛海洋化工有限公司）；大孔树脂（HPD-100 型大孔吸附树脂，沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；Innoval ODS-2半制备色谱柱（10 μm，10 mm×250 mm）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷试剂均为市售分析纯，乙腈为色谱纯。万古霉素（批号：V871983，规格：250 mg）、硫酸阿米卡星（批号：A837351，规格：1 g）（上海麦克林生化科技有限公司）。

本实验的真菌于2019年7月从湖南省江华县大玗镇长山村海拔520 m 的深绿卷柏根际土壤中分离得到，通过ITS 序列比对鉴定为Trichoderma velutinum，目前该菌株保存于中南大学湘雅药学院天然药物化学实验室。抗菌活性测试菌株来自于中南大学湘雅二医院，分别为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌 ATCC29212。

2 方法与结果

2.1 菌株发酵

将菌株从－80℃冰箱的30%甘油水溶液中接种到PDA 培养基上复苏，再接种到4 L 灭菌液体培养基中，于28℃恒温摇床中以150 r·min－1震荡培养7 d，将此种子液倒入40 L 灭菌大米固体培养基中于室温下培养28 d。

2.2 发酵产物的分离纯化

采用乙酸乙酯将固体培养基浸泡提取3 次，减压浓缩得到浸膏78 g。首先通过大孔树脂层析将粗提物划分为20%乙醇、80%乙醇、100%乙醇3 个部位。选取80%馏分（30 g）通过硅胶柱层析（以石油醚-二氯甲烷-甲醇三相体系梯度洗脱）划分为5 个组分（Fr.1 ～Fr.5）。Fr.2 经过ODS 柱层析（以水-甲醇体系梯度洗脱），得到Fr.2.1 ～Fr.2.8，Fr.2.3 和Fr.2.4 经过Sephadex LH-20 柱色谱（以甲醇等度洗脱）得到化合物1（20.1 mg）、2（4.0 mg）、3（3.2 mg）和4（3.1 mg）。Fr.3 经过ODS 柱层析（以水-甲醇体系梯度洗脱），得到Fr.3.1 ～Fr.3.5。Fr.3.2 再通过小体积硅胶柱梯度洗脱得到Fr.3.2.2，再利用半制备型高效液相色谱（以纯水-乙腈为流动相）得到化合物5（2.1 mg）和6（3.0 mg）。Fr.3.3 经过Sephadex LH-20柱色谱[以二氯甲烷-甲醇（1∶9）等度洗脱]得到Fr.3.3.2，经过半制备型高效液相色谱（以纯水-乙腈为流动相）得到化合物7（2.2 mg）、8（2.0 mg）和13（5.7 mg）。Fr.3.4 经过Sephadex LH-20 柱色谱（以甲醇等度洗脱）得到Fr.3.4.3 和Fr.3.4.4，通过重结晶得到化合物9（1.4 mg）和10（1.5 mg）。Fr.4 经过反相硅胶柱层析，得到两个白色沉淀为化合物11（6.5 mg）和12（2.4 mg）。

2.3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，易溶于DMSO，＋150°（c0.10，MeOH），HR-ESI-MS 显示：m/z531.2857 [M ＋H]＋，结合1H-NMR 和13C-NMR谱推测该化合物的分子式为C32H38N2O5；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.10（1H，s，NH-2），3.32（1H，m，H-3），2.79（1H，s，H-4），3.64（1H，m，H-7），4.50（1H，d，J＝11.4 Hz，OH-7），1.97（1H，m，H-8），2.34（1H，m，H-10α），2.70（1H，m，H-10β），1.51（3H，s，H-11），1.10（3H，s，H-12），6.22（1H，dd，J＝19.8，13.2 Hz，H-13），5.06（1H，m，H-14），2.36（1H，m，H-15α），1.97（1H，m，H-15β），2.70（1H，m，H-16），1.01（3H，d，J＝9.6 Hz，C-16a），6.27（1H，d，J＝14.4 Hz，H-17），1.71（3H，s，C-18a），4.76（1H，m，H-20），4.89（1H，d，J＝9.6 Hz，OH-20），1.76（2H，m，H-21），2.70（1H，m，H-22α），2.93（1H，m，H-22β），10.92（1H，s，NH-1'），7.05（1H，s，H-2'），7.40（1H，d，J＝12.0 Hz，H-4'），6.98（1H，t，J＝11.4，10.8 Hz，H-5'），7.06（1H，t，J＝10.2，8.4 Hz，H-6'），7.34（1H，d，J＝12.6 Hz，H-7'）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：173.9（C-1），57.1（C-3），49.3（C-4），125.5（C-5），133.5（C-6），67.7（C-7），50.9（C-8），61.6（C-9），31.9（C-10），14.7（C-11），16.2（C-12），128.5（C-13），133.4（C-14），40.7（C-15），32.9（C-16），19.8（C-16a），148.3（C-17），135.1（C-18），12.0（CH3-18a），204.1（C-19），70.1（C-20），30.5（C-21），36.5（C-22），210.3（C-23），136.2（C-1'），123.6（C-2'），109.9（C-3'），117.9（C-4'），118.5（C-5'），121.1（C-6'），111.6（C-7'），127.1（C-3'a）。 以上核磁及旋光数据与文献报道[8]基本一致，故鉴定化合物1 为chaetoglobosin E。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇，＋60°（c0.10，MeOH），HR-ESI-MS 显 示：m/z531.2864 [M ＋H]＋，结合1H-NMR 和13C-NMR谱推测该化合物的分子式为C32H38N2O5；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：3.45（1H，m，H-3），2.58（1H，m，H-4），2.54（1H，m，H-5），3.79（1H，d，J＝10.8 Hz，H-7），1.85（1H，m，H-8），2.56（1H，m，H-10α），2.83（1H，m，H-10β），1.02（3H，d，J＝6.6 Hz，H-11），5.06（1H，s，H-12α），5.24（1H，s，H-12β），6.05（1H，dd，J＝17.4，9.6 Hz，H-13），5.18（1H，m，H-14），2.41（1H，m，H-15α），1.98（H，m，H-15β），2.84（1H，m，H-16），0.91（3H，d，J＝4.8 Hz，H-16a），6.15（1H，d，J＝9.6 Hz，H-17），1.78（3H，s，H-18a），4.63（1H，m，H-20），1.41（1H，m，H-21α），1.58（1H，m，H-21β），2.76（2H，m，H-22），6.99（1H，s，H-2'），7.48（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4'），7.02（1H，t，J＝6.6 Hz，H-5'），7.08（1H，t，J＝6.6 Hz，H-6'），7.33（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7'）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：176.8（C-1），54.2（C-3），48.2（C-4），34.7（C-5），150.2（C-6），71.9（C-7），50.5（C-8），64.3（C-9），32.8（C-10），13.9（C-11），114.4（C-12），129.3（C-13），136.8（C-14），42.2（C-15），33.3（C-16），12.5（C-16a），151.2（C-17），135.8（C-18），20.3（C-18a），205.8（C-19），72.3（C-20），31.6（C-21），38.2（C-22），210.6（C-23），138.0（C-1'），125.6（C-2'），110.4（C-3'），119.4（C-4'），120.3（C-5'），122.6（C-6'），112.7（C-7'），129.3（C-3'a）。以上核磁及旋光数据与文献报道[9]基本一致，故鉴定化合物2 为chaetoglobosin Fex。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇，－15.0° （c0.53，MeOH），HR-ESI-MS 显示：m/z549.2967 [M＋H]＋，结合1H-NMR 和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C32H40N2O6；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：3.81（1H，dd，J＝9.0，4.8 Hz，H-3），2.50（1H，m，H-4），2.03（1H，m，H-5），3.16（1H，d，J＝12.0 Hz，H-7），2.63（1H，dd，J＝12.0，10.2 Hz，H-8），2.80（1H，dd，J＝14.4，4.8 Hz，H-10α），2.97（1H，dd，J＝14.4，4.8 Hz，H-10β），1.03（3H，d，J＝7.2 Hz，H-11），1.22（3H，s，H-12），5.95（1H，dd，J＝16.2，10.2 Hz，H-13），5.12（1H，dt，J＝15.6，10.8，2.4 Hz，H-14），2.41（1H，m，H-15α），1.99（1H，m，H-15β），2.75（1H，m，H-16），1.02（3H，d，J＝7.2 Hz，H-16a），6.19（1H，d，J＝9.6 Hz，H-17），1.77（3H，s，H-18a），4.66（1H，dd，J＝6.6 Hz，4.8 Hz，H-20），1.89（1H，s，OH-20），1.36（1H，m，H-21α），1.60（1H，m，H-21β），1.83（1H，m，H-22α），2.50（1H，m，H-22β），7.03（1H，s，H-2'），7.50（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4'），7.03（1H，t，J＝7.2 Hz，H-5'），7.08（1H，t，J＝7.8 Hz，H-6'），7.33（1H，d，J＝7.2 Hz，H-7'）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：176.9（C-1），54.5（C-3），45.9（C-4），40.2（C-5），74.2（C-6），73.7（C-7），47.4（C-8），65.8（C-9），33.5（C-10），13.6（C-11），24.9（C-12），129.4（C-13），135.1（C-14），42.1（C-15），34.7（C-16），20.3（C-16a），150.1（C-17），136.5（C-18），12.5（C-18a），205.8（C-19），72.6（C-20），31.9（C-21），38.7（C-22），210.1（C-23），138.1（C-1'），125.8（C-2'），110.0（C-3'），119.4（C-4'），120.3（C-5'），122.7（C-6'），112.7（C-7'），129.6（C-3'a）。以上核磁及旋光数据与文献报道[10]基本一致，故鉴定化合物3 为armochaetoglobin S。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇，＋14.5° （c0.34，MeOH），HR-ESI-MS 显示：m/z591.3073 [M ＋H]＋，结合1H-NMR 和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C34H42N2O7；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：3.78（1H，m，H-3），2.76（1H，m，H-4），1.98（1H，m，H-5），4.74（1H，d，J＝12.0 Hz，H-7），2.91（1H，m，H-8），2.83（1H，dd，J＝14.4，5.4 Hz，H-10α），2.86（1H，dd，J＝14.4，4.8 Hz，H-10β），1.03（3H，d，J＝7.8 Hz，H-11），1.15（3H，s，H-12），5.98（1H，m，H-13），5.16（1H，dt，J＝15.6，10.8，3.0 Hz，H-14），2.34（1H，m，H-15α），1.97（1H，m，H-15β），2.76（1H，m，H-16），1.02（3H，d，J＝7.2 Hz，H-16a），6.21（1H，d，J＝9.0 Hz，H-17），1.77（3H，s，H-18a），4.71（1H，t，J＝5.4 Hz，H-20），1.46（1H，m，H-21α），1.68（1H，m，H-21β），2.64（1H，m，H-22α），2.92（1H，m，H-22β），7.06（1H，s，H-2'），7.51（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4'），7.02（1H，t，J＝7.2 Hz，H-5'），7.09（1H，t，J＝7.2 Hz，H-6'），7.33（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7'），1.98（3H，s，H-2''）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：176.4（C-1），55.3（C-3），44.9（C-4），41.9（C-5），73.9（C-6），75.0（C-7），46.2（C-8），65.2（C-9），33.0（C-10），13.4（C-11），24.9（C-12），128.6（C-13），135.5（C-14），41.9（C-15），34.6（C-16），20.2（C-16a），150.0（C-17），136.4（C-18），12.4（C-18a），205.6（C-19），72.7（C-20），32.3（C-21），38.9（C-22），210.3（C-23），138.1（C-1'），125.5（C-2'），110.5（C-3'），119.4（C-4'），120.2（C-5'），122.3（C-6'），112.6（C-7'），129.2（C-3'a），172.5（C-1''），21.0（C-2''）。 以上核磁及旋光数据与文献报道[10]基本一致，故鉴定化合物4 为7-O-acetylarmochaetoglobin S。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇，＋77.3° （c0.50，EtOH），HR-ESI-MS 显示：m/z300.1717 [M ＋H]＋，结合1H-NMR 和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C17H21N3O2；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：7.07（1H，s，H-2），7.31（1H，d，J＝10.2 Hz，H-4），6.99（1H，t，J＝8.4 Hz，H-5），7.06（1H，t，J＝8.4 Hz，H-6），7.61（1H，d，J＝9.6 Hz，H-7），3.21（1H，dd，J＝17.4，4.8 Hz，H-8α），3.42（1H，dd，J＝18.0，6.0 Hz，H-8β），4.31（1H，dd，J＝5.4，1.8 Hz，H-9），3.63（1H，dd，J＝5.4，2.4 Hz，H-12），1.22（1H，m，H-15），0.38（1H，m，H-16α），0.55（1H，m，H-16β），0.52（3H，t，J＝7.8 Hz，H-17），0.60（3H，d，J＝8.4 Hz，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：125.9（C-2），109.9（C-3），129.6（C-3a），120.1（C-4），120.2（C-5），122.6（C-6），138.2（C-7），112.6（C-7a），40.1（C-8），57.5（C-9），169.3（C-11），61.1（C-12），170.2（C-14），30.4（C-15），24.5（C-16），11.9（C-17），15.3（C-18）。以上核磁与旋光数据与文献报道[11]基本一致，故鉴定化合物5 为cyclo-（L-Trp-D-Ile）。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇，－10.6° （c0.14，MeOH），HR-ESI-MS 显示：m/z300.1716 [M ＋H]＋，结合1H-NMR 和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C17H21N3O2；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：7.06（1H，s，H-2），7.31（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），6.99（1H，t，J＝16.8 Hz，7.2Hz，H-5），7.07（1H，t，J＝16.8，7.2 Hz，H-6），7.59（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7），3.11（1H，dd，J＝14.4，4.2 Hz，H-8α），3.48（1H，dd，J＝14.4，3.6 Hz，H-8β），4.27（1H，dd，J＝4.2，3.6 Hz，H-9），3.57（1H，dd，J＝10.2，4.8 Hz，H-12），0.17（1H，ddd，J＝13.8，10.2，4.8 Hz，H-15α），0.66（1H，ddd，J＝13.8，9.6，4.2 Hz，H-15β），1.14（1H，m，H-16），0.46（3H，d，J＝6.6 Hz，H-17），0.60（3H，d，J＝6.6 Hz，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：126.0（C-2），109.6（C-3），129.4（C-3a），120.2（C-4），120.3（C-5），122.6（C-6），137.9（C-7），112.6（C-7a），45.2（C-8），54.3（C-9），170.0（C-11），57.6（C-12），170.7（C-14），24.7（C-15），30.8（C-16），21.4（C-17），23.4（C-18）。以上核磁与旋光数据与文献报道[12]基本一致，故鉴定化合物6 为cyclo-（L-Trp-L-Leu）。

化合物7：白色针晶，易溶于DMSO，－249.5°（c1.00，MeOH），mp：281 ℃，HR-ESI-MS显示：m/z334.1560 [M ＋H]＋， 结合1H-NMR和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C20H19N3O2；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：10.89（1H，s，H-1），6.96（1H，s，H-2），7.48（1H，d，J＝8.4 Hz，H-4），6.98（1H，t，J＝7.8 Hz，H-5），7.08（1H，t，J＝7.2 Hz，H-6），7.32（1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），2.52（1H，dd，J＝14.4，5.4 Hz，H-10α），2.81（1H，dd，J＝14.4，4.2 Hz，H-10β），3.98（1H，m，H-11），7.92（1H，s，H-12），3.89（1H，m，H-14），7.70（1H，s，H-15），2.45（1H，dd，J＝13.2，4.8 Hz，H-17α），1.83（1H，dd，J＝13.2，7.2 Hz，H-17β），7.16（1H，m，H-19），6.70（1H，m，H-20），7.17（1H，m，H-21），6.70（1H，m，H-22），7.16（1H，m，H-23）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：120.9（C-2），108.8（C-3），118.5（C-4），118.8（C-5），124.5（C-6），111.4（C-7），127.6（C-8），136.1（C-9），29.7（C-10），55.3（C-11），166.3（C-13），55.7（C-14），170.0（C-15），166.9（C-16），39.9（C-17），136.5（C-18），128.1（C-19），129.8（C-20），126.5（C-21），129.8（C-22），128.1（C-23）。以上核磁与旋光数据与文献报道[13]基本一致，故鉴定化合物7 为cyclo-（L-Trp-L-Phe）。

化合物8：白色簇晶，易溶于甲醇，－108° （c0.30，MeOH），mp：242 ℃，HR-ESI-MS 显示：m/z373.1669 [M ＋H]＋，结合1H-NMR 和13C-NMR谱推测该化合物的分子式为C22H20N4O2；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：4.06（1H，dd，J＝7.2，4.2 Hz，H-2），2.18（1H，dd，J＝14.4，7.2 Hz，H-3α），2.92（1H，dd，J＝14.4，4.2 Hz，H-3β），7.44（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），7.02（1H，t，J＝7.2 Hz，H-5），7.10（1H，t，J＝7.2 Hz，H-6），7.31（1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），6.48（1H，s，H-8a）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：57.0（C-2），31.5（C-3），109.5（C-3a），128.7（C-3b），119.8（C-4），120.2（C-5），122.7（C-6），112.6（C-7），138.2（C-7a），126.1（C-8a），169.9（C-9）。以上核磁与旋光数据与文献报道[14]基本一致，故鉴定化合物8 为cyclo-（L-Trp-L-Trp）。

化合物9：白色针晶，易溶于DMSO，HRESI-MS 显示：m/z261.1611 [M ＋H]＋， 结合1H-NMR 和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C15H20N2O2；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.10（1H，s，NH-1），3.57（1H，m，H-3），7.88（1H，s，NH-4），4.20（1H，m，H-6），1.39（1H，m，H-7），0.59（1H，m，H-8α），0.56（1H，m，H-8β），0.56（3H，m，H-9），0.54（3H，d，J＝7.2 Hz，H-10），2.84（1H，dd，J＝13.8，5.4 Hz，H-11α），3.16（1H，dd，J＝13.8，4.2 Hz，H-11β），7.17 ～7.23（1H，m，H-13），7.17～7.23（1H，m，H-14），7.17～7.23（1H，m，H-15），7.17 ～7.23（1H，m，H-16），7.17 ～7.23（1H，m，H-17）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：166.4（C-2），58.7（C-3），166.3（C-5），55.0（C-6），37.8（C-7），23.1（C-8），11.8（C-9），14.4（C-10），37.6（C-11），136.3（C-12），130.4（C-13），127.9（C-14），126.5（C-15），127.9（C-16），130.4（C-17）。以上核磁数据与文献报道[15]基本一致，故鉴定化合物9 为cyclo-（L-Ile-L-Phe）。

化合物10：白色针晶，易溶于DMSO， －29.8°（c0.10，MeOH），mp：284 ℃，HR-ESI-MS 显示：m/z261.1605 [M ＋H]＋， 结合1H-NMR 和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C15H20N2O2；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.11（1H，s，NH-1），3.46（1H，m，H-3），8.08（1H，s，NH-4），4.17（1H，m，H-6），0.09（1H，m，H-7α），0.73（1H，m，H-7β），1.40（1H，m，H-8），0.62（3H，d，J＝6.6 Hz，H-9），0.59（3H，d，J＝6.6 Hz，H-10），2.84（1H，dd，J＝13.2，4.8 Hz，H-11α），3.13（1H，dd，J＝13.2，3.6 Hz，H-11β），7.12 ～7.28（1H，m，H-13），7.12～7.28（1H，m，H-14），7.12～7.28（1H，m，H-15），7.12 ～7.28（1H，m，H-16），7.12 ～7.28（1H，m，H-17）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：167.6（C-2），55.5（C-3），166.3（C-5），52.3（C-6），43.7（C-7），22.9（C-8），22.8（C-9），21.4（C-10），38.5（C-11），136.3（C-12），130.5（C-13），128.2（C-14），126.8（C-15），128.2（C-16），130.5（C-17）。以上核磁与旋光数据与文献报道[16]基本一致，故鉴定化合物10 为Cyclo-（L-Leu-L-Phe）。

化合物11：白色粉末，易溶于DMSO，HR-ESIMS 显示：m/z282.1209 [M ＋H]＋，结合1H-NMR和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C11H15N5O4；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.39（1H，s，H-2），8.14（1H，s，H-8），6.00（1H，d，J＝5.4 Hz，H-1'），4.34（1H，m，H-2'），4.36（1H，m，H-3'），3.98（1H，m，H-4'），3.66（1H，dd，J＝12，3.6 Hz，H-5'α），3.57（1H，dd，J＝12，3.6 Hz，H-5'β），3.30（3H，s，O-CH3），7.35（1H，s，NH2-6）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：139.7（C-2），149.0（C-4），119.3（C-5），156.2（C-6），152.6（C-8），82.5（C-1'），85.8（C-2'），68.8（C-3'），86.5（C-4'），61.5（C-5'），57.5（OCH3）。以上核磁数据与文献报道[17]基本一致，故鉴定化合物11 为2'-O-methyladenosine。

化合物12：白色粉末，易溶于DMSO，HRESI-MS 显示：m/z268.1053 [M ＋H]＋， 结合1H-NMR 和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C10H13N5O4；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.16（1H，s，H-2），8.37（1H，s，H-8），5.90（1H，d，J＝6.0 Hz，H-1'），4.63（1H，m，H-2'），4.17（1H，m，H-3'），3.99（1H，m，H-4'），3.58（1H，m，H-5'α），3.69（1H，m，H-5'β），7.38（2H，s，NH2-6），5.25（1H，s，OH-5'），5.47（1H，s，OH-2'），5.50（1H，s，OH-3'）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：152.5（C-2），149.1（C-4），119.5（C-5），156.2（C-6），139.6（C-8），88.0（C-1'），73.6（C-2'），70.8（C-3'），86.1（C-4'），61.8（C-5'）。以上核磁数据与文献报道[18]基本一致，故鉴定化合物12 为β-adenosine。

化合物13：黄色油状物，易溶于甲醇，HRESI-MS 显示：m/z203.1188 [M ＋H]＋， 结合1H-NMR 和13C-NMR 谱推测该化合物的分子式为C12H14N2O；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：6.91（1H，s，C-2），7.55（1H，d，J＝7.8 Hz，C-4），7.08（1H，t，J＝7.2 Hz，C-5），6.99（1H，t，J＝7.2 Hz，C-6），7.31（1H，d，J＝7.8 Hz，C-7），3.46（2H，t，J＝7.2 Hz，C-10），2.93（2H，t，J＝6.6 Hz，C-11），1.91（3H，s，C-14）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：122.4（C-2），113.4（C-3），119.4（C-4），119.7（C-5），123.5（C-6），112.4（C-7），138.3（C-8），128.9（C-9），26.3（C-10），41.7（C-11），173.4（C-13），22.7（C-14）。以上核磁数据与文献报道[19]基本一致，故鉴定化合物13 为N-acetyltryptamine。

2.4 抗菌活性评价

采用96 孔板倍比稀释法，分别制备金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）和大肠埃希菌（Escherichia coli）的悬浮液并稀释至1×106CFU·mL－1备用。将13 个样品用生物级DMSO 溶解制备成1024 μg·mL－1的母液，取母液置96 孔板第一孔并用肉汤稀释至128 μg·mL－1，倍比稀释后各孔质量浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、0 μg·mL－1，再于每孔中加入菌液，使每孔最终质量浓度为64、32、16、8、4、2、1、0 μg·mL－1， 置于30℃恒温培养箱中培养8 h 并观察细菌生长情况。以盐酸万古霉素和硫酸阿卡米星为阳性对照，以同等浓度DMSO 作为阴性对照，目视观察法读取MIC值。结果表明化合物1 ～13 在质量浓度 64 μg·mL－1下对4 个测试菌株均未显示出抑制活性。

3 讨论

植物根际土壤真菌作为一类独特的微生物资源，参与植物体及周围生态的物质循环，植物根际分泌物及根际土壤能够为其提供充足碳源和可利用元素，同时根际土壤真菌大多能通过化学途径为植物体提供生物防治作用，因此其具有强大的产活性代谢产物的潜力。再者，植物根际土壤真菌物种多样，能提供丰富的研究资源，具备极大的研究前景。本研究从植物根际土壤真菌Trichoderma velutinum的代谢产物中分离得到13个化合物，其中化合物1 ～10 为首次从木霉属真菌中分离得到。虽然本研究中化合物1 ～13 对所测4 株致病菌均未表现出抑制作用，但经文献检索发现细胞松弛素类化合物1 ～3 对人前列腺癌细胞和小鼠黑色素瘤细胞具有较好的增殖抑制活性[20-22]；二酮哌嗪化合物9 ～10 具有良好的抗炎活性[23]。本研究丰富了木霉属真菌化学成分多样性，可为土壤真菌资源的开发利用提供参考。