不同相思树种根际与非根际土壤细菌群落结构及多样性特征

刘 芳，袁宗胜，曾志浩，林鸿艳，周丽丽，潘 辉*

（1.福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002；2.闽江学院 海洋研究院，福建 福州 350108）

根际是植物进行正常生长发育，与植物根系紧密相关，并与微生物群系共同构成的一个复杂的生态区系，植物通过根际与外界环境进行物质与能量交换，根际微生物所形成的微生物环境对植物生长起到极其重要的作用［1－2］。植物根系和微生物之间的作用是相互的，根际微生物能够通过促进植物对营养的吸收以及直接的作用促进植物生长发育，根际微生物群落的结构组成和功能多样性受土壤类型、植物基因型、根系分泌物及植物生长周期等因素的影响［3－4］。多位学者已对土壤细菌群落结构、土壤微生物的作用，以及土壤微生物、植物群落及土壤特征之间的关系等进行了研究［5-8］。研究表明，根际微生物群落结构和多样性影响植物的生长发育，同样，植物类型的多样性也会影响根际微生物群落的结构［9-11］。

相思类树种是常绿乔木，属含羞草科（Mimosaceae）金合欢属（Acacia Wild）。研究表明，相思类树种生长迅速、萌生能力强、根系发达，耐贫瘠、盐碱和干旱，是沿海地区沙质土壤更新造林的理想树种［12］。许多林学专家及林业工作者已开展了相思树的引种、栽培技术及经营管理等方面的研究［13-14］。开展相思树根际与内生微生物群落结构差异性以及关键微生物功能的研究，对于充分发挥相思树种的改良土壤、维持地力、保持水土等生态功能具有重要的意义。

本文利用Illumina NovaSeq高通量测序技术，对福建省漳浦中西国有林场的不同相思树种（以同一生境的桉树为对照）的根际和非根际土壤细菌群落的多样性特征进行了分析，以期为相思树内生功能菌株的挖掘和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集

采样地设在中国福建省漳浦中西国有林场，该区属亚热带季风气候，地理坐标为117°56′E、24°28′N，年平均气温21.8 ℃，年降水量1600 mm。在2019年11月，分别采集厚荚相思、卷荚相思、黑木相思、直干相思、马占相思等树种的根际土壤及非根际土壤样本。

土壤样本采集：随机选取健壮植株，在距树干1 m左右的位置用铁铲挖取50~60 cm深的树根，将树根取出，并选取黏在根上粒径小于1cm的土壤作为根际土壤样本，选取离植株根部30 cm以外的土壤作为非根际土壤样本。采集样本后立即将其放入无菌样本袋中，在24 h内置于-20 ℃保存。本研究共采集样本30个，每组3个样本，样本编号分别为厚荚相思根际土壤（HJ.D）和非根际土壤（HJ.E）；卷荚相思的根际土壤（JJ.D）和非根际土壤（JJ.E）；黑木相思的根际土壤（HM.D）和非根际土壤（HM.E）；直干相思的根际土壤（ZZ.D）和非根际土壤（ZZ.E）；马占相思的根际土壤（MZ.D）和非根际土壤（MZ.E）。

1.2 样本基因组DNA的提取及高通量测序

采用试剂盒TIANGEN Plant Genomic DNA kit（50）DP305-02并按照其说明书的步骤提取样本基因组DNA。采用琼脂糖电泳检测基因组DNA的浓度和纯度。将检测合格的DNA进行PCR扩增，形成测序文库［15］，并将质检合格的文库在Illumina NovaSeq PE250测序平台进行高通量测序（由北京诺禾致源科技股份有限公司完成）。

1.3 数据分析

对测序得到的双端Reads （PE Reads）进行拼接、过滤，除去嵌合体序列，最终得到有效数据（Effective Tags）。在97%相似度水平下对有效数据进行聚类分析，获得OTU（分类操作单元）。采用RDP Naive Bayesian Classifier分类算法进行注释。使用BioVenn在线软件进行Venn图绘制；使用Qiime软件计算观测物种数、Chao指数、Shannon指数等，分析不同相思树种根内生细菌群落的结构特征及差异［16-18］。

2 结果与分析

2.1 测序结果及OTU分析

经测序分析，30个相思树样本序列长度在61029~90690条，总有效数据为2314745条。根据相似度在97%以上的序列聚类为1个OTU的原则进行有效OTUs统计，从图1的稀释曲线可以看出，当样本测序深度达15000条时，稀释曲线都趋于平缓，表明本次测序深度足以可靠地描述与样本相关的细菌群落。

图1 相似度为97%水平下的稀释曲线

Venn图可用于统计多个样本共有和特有的OTU数目，能比较直观地展现样本的OTU数目组成相似性及重叠情况。图2为不同相思树种根际和非根际细菌OTUs的Venn图。从不同样本来源来看，不同相思树种根际土壤样本细菌的OTU数目表现为黑木相思＞直干相思＞马占相思＞卷荚相思＞厚荚相思；不同相思树种非根际土壤样本细菌的OTU数目表现为厚荚相思＞直干相思＞黑木相思＞马占相思＞卷荚相思。不同相思树种同一来源土壤样本细菌的OTU数目未呈现出完全一致的变化趋势，但总体上表现为根际样本＞非根际样本。

图2 不同相思树种根际、非根际共有的细菌OTUs数量

5种不同相思树种根际土壤样本有683个共有OTUs，厚荚相思、卷荚相思、黑木相思、直干相思及马占相思独有的OTUs数分别为115、91、212、166及180个。5种不同相思树种非根际土壤样本有651个共有OTUs，厚荚相思、卷荚相思、黑木相思、直干相思及马占相思独有的OTUs数分别为128、81、151、145及168个。

2.2 细菌多样性分析

Alpha多样性分析可以反映样本细菌群落的多样性和物种丰度， ACE和Chao1指数能反映物种的丰富度，香农（Shannon）指数和辛普森（Simpson）指数能反映物种的多样性。ACE和Chao1指数数值越大，说明根内生细菌的数量越多；香农指数和辛普森指数数值越大，说明根内生细菌的多样性越高。由表1可知：不同相思树种根际土壤细菌数量的排序为黑木相思＞马占相思＞直干相思＞卷荚相思＞厚荚相思；不同相思树种根际土壤细菌多样性的排序为黑木相思＞卷荚相思＞直干相思＞马占相思＞厚荚相思；不同相思树种非根际土壤细菌数量的排序为厚荚相思＞黑木相思＞直干相思＞马占相思＞卷荚相思；不同相思树种非根际土壤细菌多样性的排序为厚荚相思＞直干相思＞黑木相思＞马占相思＞卷荚相思。由此可知，在不同相思树种的根际土壤样本中，黑木相思根际土壤细菌的丰富度和多样性最高，同一相思树种根际土壤细菌的丰富度和多样性的变化规律相同。在不同相思树种的非根际土壤样本中，厚荚相思非根际土壤细菌的丰富度和多样性最高，同一相思树种非根际土壤样本细菌的丰富度和多样性的变化规律不同。相同相思树种根际土壤细菌的丰富度和多样性均高于非根际土壤细菌的。

表1 不同土壤样品的测序统计结果与Alpha多样性指数

2.3 细菌群落结构分析

比较了不同相思树种根际和非根际细菌群落在纲水平上的相对丰度，结果如图3所示，各样本中占据主导地位的细菌群落均为Acidobacterlia和Alphaproteobacteria，其次为Gammaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria。其中，Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria在同一相思树种根际土壤样本中所占丰度均高于非根际土壤样本，Acidobacterlia在同一相思树种非根际土壤样本中所占丰度均高于根际土壤样本。

图3 不同相思树种土壤细菌群落在纲水平上的相对丰度

从图4可以看出，不同相思树种土壤样本在目水平上的优势菌群存在较大差异。通过比较不同树种根内生细菌群落丰度比例可知，在不同相思树种的根际土壤和非根际土壤样本中，Acidobacteriales占主导地位，其次为Rhizobiales、unidentified_Gammaproteobacteria、unidentified_Alphaproteobacteria和Frankiales。在相同相思树种的根际土壤样本中Acidobacteriales、Rhizobiales、unidentified_Gammaproteobacteria和Frankiales的群落丰度均高于非根际土壤样本中的。Xanthomonadales在卷荚相思、黑木相思和直干相思根际土壤样本中的群落丰度均高于厚荚相思、马占相思及不同相思树种非根际土壤样本中的。不同相思树种根际和非根际土壤细菌群落在目水平上的相对丰度存在差异。

如图5所示，10组土壤样本的细菌群落丰度居前10的科主要包括Xanthobacteraceae、Beijerinckiaceae、Enterobacteriaceae、Pseudonocardiaceae、Burkholderiaceae、unidentified_Gammaproteobacteria、Pseudomonadaceae、unidentified_Acidobacteriales、Caulobacteraceae、Acidothermaceae。通过比较不同相思树种根内生细菌在科水平上的群落丰度比例可知， Xanthobacteraceae、Acidothermaceae、unidentified_Acidobacteriales在不同相思树种的根际土壤及非根际土壤样本中均占优势。同一相思树种根际土壤样本的细菌丰度均高于非根际土壤样本的；不同相思树种根内生细菌群落在科水平上的相对丰度存在差异。

图5 不同相思树种土壤细菌群落在科水平上的相对丰度

3 结论与讨论

由于不同树种的根部具有不同的吸收营养和分泌物质的能力，同时植物的根状体沉积和根分泌物能促进根际土壤和根平面的化学吸引和定殖，所以形成了独特、高度丰富和多样的根际微生物群落［19-25］。笔者的研究表明：不同相思树种在根际细菌群落的差异性。

已有研究表明，土壤根系富集的微生物在植物的生长发育过程中扮演着非常重要的角色，包括增强植物的抗逆性、促进对营养的吸收，以及响应植物的周期性［26］。Smalla等对马铃薯等作物根际微生物群落结构的研究表明，根际微生物群落结构和多样性影响植物的生长发育，同样，植物类型的多样性也会影响根际微生物群落结构［5］。

植物与微生物的互作是近年来微生物学研究的新热点，通过系统了解植物和微生物的功能和作用机制，研究植物在不同生长阶段与微生物之间的相互作用，对提高植物的生产力，提高农作物的产量和品质，开发有益的微生物进行可持续的农林业生产具有重要的实践意义［27］。