云南地方稻耐低钾种质资源的筛选和评价

唐海浪，程在全，罗 琼*，钟巧芳*

（1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点试验室/农业农村部 西南作物基因资源与种质创制重点试验室，云南 昆明 650205）

钾是植物生长发育必需的三大营养元素之一，与植物的各种代谢密切相关，在作物的生长、产量、品质和抗逆性等方面具有重要作用［1－3］。水稻（Oryza sativa L.）是我国重要的粮食作物之一，60%的人口以稻米为主食。水稻生长所需的钾营养主要来自土壤，而我国1/4~1/3的耕地土壤处于缺钾或严重缺钾状态，在南方稻区土壤缺钾尤为严重。我国钾资源匮乏，钾肥年产量少，所需的大量钾肥主要依靠进口［4］。为了保证水稻的高产稳产，生产者长期偏重施用钾肥。钾肥的长期大量增施，不仅造成生产成本增加、肥料利用率降低、土壤肥力下降，而且还带来稻米品质下降、环境污染等一系列问题［5－7］。充分利用我国丰富的水稻种质资源，发掘水稻自身的遗传潜力，培育耐低钾水稻品种是解决我国钾资源短缺等问题，促进水稻生产可持续发展的有效途径［8－10］。优异耐低钾水稻资源的发掘是水稻钾高效育种的关键和基础。大量研究表明，不同基因型水稻的钾素吸收利用能力存在明显差异［11-14］，且这种能力是受遗传控制的数量性状［15-18］。已有研究表明，耐低钾基因型对低钾胁迫具有较强的耐性，能够保持较强的生长势、较高的钾吸收和利用效率，而且能够获得较高的产量。目前在钾高效水稻种质资源筛选、耐低钾遗传机制、QTL定位及相关基因等方面已取得较好的进展。刘国栋等利用水培法对86种不同籼稻材料进行了筛选比较，发现其吸钾速率、生物量和钾素利用效率的基因型差异十分显著，吸钾速率的基因型差异可达1倍［19］。张宁等利用2个不同供钾浓度的水培试验，以相对耐低钾指数为评价指标，筛选出2个耐低钾水稻品种、6个中等耐低钾水稻品种和1个钾敏感品种［20］。王广洋等利用水培法对257份水稻种质进行了筛选比较，发现供试水稻种质在低钾耐性上存在显著差异，并从中筛选出8个耐低钾品种［21］。陈璇利用混池分组分析法对由20个耐低钾植株和20个不耐低钾植株分别混合成的2个样本池及亲本进行全基因组重测序，通过对候选的36个多态性位点进行功能注释，找到了2个可能在低钾条件下参与水稻钾离子吸收或转运的耐低钾候选基因OsHAK3和OsNAC25［22］。Venkata等利用IL群体检测到3个钾离子浓度的QTL和4个相对茎叶钾含量的QTL，可解释表型变异的5.84%~14.80%［15］。罗曦等根据综合指数从159份遗传差异较大的水稻品种中筛选出18份耐低钾和10份低钾敏感的水稻品种。利用耐低钾水稻品种台农67和低钾敏感品种制西构建重组自交系，共检测到27个耐低钾相关性状的QTL，其LOD值为2.52~9.23，可解释表型变异的2.22%~7.25%，其中贡献率最高的QTL是qKC-2，该QTL定位在水稻2号染色体上，可能是1个控制水稻钾含量的未知基因［18］。有关不同水稻基因型钾素营养效率的差异，国内外学者已经进行了大量研究，但目前对水稻钾高效基因型还没有统一的筛选指标和可靠的评价体系。传统的研究多以大田成熟期产量作为评定品种耐低钾的主要标准，但明显存在周期长、费工费时、不易重复等缺点；相比之下，苗期鉴定具有耗时短、容量大、重复性强、易于活体鉴定和环境影响小等优点［10，18，20－21，23］。因此，选择合适的苗期筛选指标，建立科学、快速、有效的苗期耐低钾基因型鉴定方法，对大量的钾高效基因型筛选工作具有重要的意义。云南是世界上最大的稻种遗传生态多样性中心之一，分布了大量丰富多样的地方特色水稻品种资源。这些资源具有许多优良的遗传特性及其控制基因，是宝贵的基因库，从中发掘优异耐低钾种质资源的可能性非常大［24-27］。鉴于此，本研究采用水培法对已进行大田抗病性鉴定的84份云南地方稻种质材料进行了耐低钾筛选和评价，并获得了一些优异的耐低钾水稻资源材料，可为耐低钾水稻种质创新和耐低钾水稻优良品种培育提供优良的材料，同时为水稻耐低钾基因的发掘以及水稻耐低钾机制的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

前期经大田抗病性鉴定挑选出的具有较好抗病能力的84份云南地方稻种质材料（表1），由云南省农业科学院作物种质库提供。

表1 供试的84份云南地方稻种质材料信息

1.2 水稻苗的水培培养

水培营养液参照国际水稻所的水培配方（稍作改良）［23］，配制成除K+浓度不同，其余成分完全相同的完全营养液和低钾营养液，调节pH值至5.5～5.8。将不同基因型的水稻种子分别取50粒，加入3%的过氧化氢溶液灭菌消毒30 min，再用灭菌蒸馏水洗5~8次，然后转入灭菌的组培瓶内，置于28 ℃恒温培养箱中暗培养2~3 d，直至水稻露白。随后在28 ℃下光照培养8~10 d，待水稻苗生长至2叶期时，从中选取长势一致的水稻苗，去其胚乳，采用根朝下、芽朝上的方式将其移入去底的洁净96孔PCR板中，在蒸馏水中过渡水培3~5 d，然后将其转入完全营养液或低钾营养液中培养，每3 d更换1次营养液，直至水稻苗生长至5叶期。每个水稻材料设置8个重复，试验重复3次。

1.3 最适宜低钾胁迫浓度的确定

随机选取8个不同的水稻材料，按上述方法进行水培培养，在2叶期时分别将其移入0、0.5、1、2、3、4、5、10、20、40 mg/L共10个不同的钾离子浓度营养液中，在28 ℃条件下，每天光照培养16 h，暗培养8 h；待培养至5叶期时，观察植株的生长情况和缺钾症状，并测量每份材料的根长、株高、鲜重，干重等指标，筛选出最适宜的低钾胁迫浓度。

1.4 植株耐低钾能力相关指标的测定

将待筛选的84份地方稻资源同时置于低钾营养液和完全营养液双浓度水培液中，将其培养至5叶期。在培养过程中，注意观察水稻的生长发育情况和缺钾症状。待生长至5叶期时，测量植株单株的根长、株高、地上部鲜重、地上部干重等性状指标。在测量植株鲜重后，收集植株地上部，将其置于烘箱（105 ℃）中杀青10 min，然后在80 ℃下烘至恒重，最后称重。

1.5 耐低钾品种的综合评价

计算不同基因型水稻幼苗各性状的相对耐性指数（低钾胁迫下的测定值/正常供钾下的测定值）。采用平均分配权重法，选择根长、株高、鲜重、地上部干重这4个苗期主要性状的相对耐性指数，计算耐低钾综合指数（SYI），SYI=同品种4个性状的相对耐性指数之和/4。再根据耐低钾综合指数，按照表2中的评价标准，对各水稻材料苗期的耐低钾能力进行综合评价，最终筛选出较优异的耐低钾水稻品种。

表2 水稻苗期耐低钾综合指数的评价标准

2 结果与分析

2.1 最适宜低钾胁迫浓度的确定

8个地方稻材料在不同K+浓度处理下的5叶期生长情况如图1所示，在0~2 mg/L K+浓度范围内，随着K+浓度升高，植株生长越旺盛，株高增高，叶片变绿，缺钾症状越少，根系越发达。当K+浓度为2 mg/L时，水稻生长发育状况明显得到改善，叶片无缺钾症状，根系比较发达。当K+浓度继续升高至3~20 mg/L范围时，与完全营养液下的水稻相比，水稻的生长发育（如株高和根长等）反而受到了不同程度的抑制，叶尖变黄，植株变矮，出现缺钾症状。

图1 部分地方稻材料在不同K+浓度水培液中的生长情况

不同K+浓度处理对8个地方稻材料株高、根长、鲜重、干重等性状的影响如表3所示，在不同K+浓度处理下，8个材料的株高、根长、鲜重、干重有显著差异。当K+浓度为2 mg/L时，株高、根长、鲜重、干重这4个性状均显著升高，8个材料的生长状态和性状值最接近完全培养条件下的。因此确定以2 mg/L作为水稻苗期耐低钾筛选的最佳低钾胁迫浓度。

表3 不同K+浓度处理对水稻苗期株高、根长、鲜重、干重的影响

2.2 不同水稻基因型的苗期耐低钾相关性状差异

在2种不同钾浓度营养液中，5叶期不同水稻材料间的生长发育情况出现了明显差异（图2）。在低钾培养液中，不耐低钾水稻出现明显的缺钾症状，植株矮小，叶片发黄，出现褐斑，根系细弱，逐渐枯死。耐低钾水稻的生长状态接近于完全营养液中的，直至5叶期时生长发育仍良好，根系发达，缺钾症状不明显（图3）。

图2 在2种K+浓度下部分地方稻材料在5叶期的生长情况

图3 在低钾（2 mg/L）胁迫下不同材料在5叶期的根系和株高表现

在2种钾浓度处理下，5叶期水稻株高、根长、鲜重和干重的数据统计和方差分析结果如表4所示，发现株高、根长、鲜重和干重这4个性状在不同K+浓度处理和不同基因型间均存在显著差异。

表4 在两种钾浓度下水稻苗期耐低钾相关性状的差异

2.3 不同基因型水稻苗期耐低钾性状的相对耐性指数差异及相关性分析

为了消除不同水稻基因型之间的生物学特性差异，引入相对耐性指数（R）作为钾高效水稻种质筛选的相对指标。在2种钾浓度处理下，株高、根长、地上部鲜重和地上部干重这4个苗期性状的相对耐性指数如表5所示。从表5可以看出：在4个性状中，地上部鲜重和地上部干重的相对耐性指数都较小，平均值分别为68.27%和70.09%；株高和根长的相对耐性指数均较大，平均值分别为91.70%和115.88%。这说明地上部鲜重和地上部干重对低钾胁迫较敏感，遗传力小；株高和根长对低钾胁迫不敏感，遗传力大。从变异系数可知，株高、根长、地上部鲜重和地上部干重的相对耐性指数的变异都比较大。

表5 在2种钾浓度处理下水稻苗期性状的相对耐性指数

在2种钾浓度处理下，84份地方稻苗期相对株高、相对根长、地上部相对鲜重和地上部相对干重的分布频数如图4所示。从图4中可以看出，在低钾处理下水稻的株高、根长、地上部鲜重和地上部干重均明显低于正常处理下的。具体来说，相对株高的范围为34.83%～175.64%，主要分布在60%～90%，均值为91.70%；相对根长的范围为57.23%～281.63%，主要分布在65%～150%，均值为115.88%；地上部相对鲜重的范围为25.22%～130.50%，主要分布在35%～110%，均值为68.27%；地上部相对干重的范围为23.28%～121.00%，主要分布在50%～95%，均值为70.09%。

图4 84份地方稻苗期耐低钾性状的相对耐性指数的分布频率

各性状相对耐性指数之间的相关性分析结果如表6所示，结果表明：株高与根长、地上部鲜重和地上部干重均呈显著相关，相关系数分别为0.402、0.395和0.420。

表6 各性状相对耐性指数之间的相关系数

2.4 耐低钾品种的综合评价

在2种钾浓度处理下，84份地方稻苗期株高、根长、地上部鲜重和地上部干重的耐低钾综合指数的分布频率如图5所示。综合指数的分布范围为0.368～1.480，主要分布在0.67～1.00，均值为0.865。根据综合指数并结合稻苗的实际生长表现，对84份地方稻材料的耐低钾能力进行综合评价和等级划分（表7），最终筛选出11个耐低钾品种（表8），这些材料苗期各性状的相对耐性指数均高于90%，且SYI＞1.1；另外筛选出20个较耐低钾品种（SYI为0.903～1.480）。

图5 84份地方稻苗期4个性状的耐低钾综合指数的分布频率

表7 84份地方稻苗期耐低钾能力的综合评价结果

表8 耐低钾品种的相对耐性指数和耐低钾综合指数

3 小结与讨论

钾是植物生长必需的元素之一，与植物的生长发育和新陈代谢等密切相关。前人诸多研究表明，不同基因型水稻在低钾耐性上具有明显的遗传差异性［11-14］，这为从云南丰富多样的地方稻资源中筛选和培育优异耐低钾水稻种质提供了理论依据和可能性。本研究发现，在低钾（2 mg/L K+）条件下，84个云南地方稻品种的性状表现出明显差异，其中株高、地上部鲜重和地上部干重这3个性状的平均值均小于正常处理，而根长的平均值明显高于正常处理；在低钾条件下，大部分稻苗（63.10%）均表现出不同程度的植株矮小，生长缓慢，茎秆细弱，叶呈现褐斑，下部叶片发黄，部分品种（36.90%）生长状况较佳，接近于正常处理，但也有少部分品种（13.10%）的性状甚至超过正常处理的，这与已有的研究结果［10-13，18-21，23］基本一致。

目前有关水稻钾高效基因型筛选的研究很多，在这类研究中水培法、盆栽法、大田试验法等都是常用方法。但总体而言，水稻钾高效基因型的筛选目前还缺乏统一的筛选指标和可靠的评价体系。由于盆栽法和大田试验法等难以控制单一因素的缺乏且生长周期长，易受天气、季节和气候的影响等，对于大规模的批量筛选可行性低［10，18，20－21，23］。本试验采用水培法，与大田试验相比，水稻的生长条件如温度、水分、光照可人工调控，减少了不可控因素对耐低钾水稻筛选的影响，且鉴定周期短、更高效。此外本试验鉴定材料的数量多，将材料置于去底的96孔PCR板上进行培养，不仅节省了空间和成本，而且操作相对简便有效，可以作为大规模品种前期高效、快速筛选的方法之一。

本试验在2 mg/L低钾处理下，利用由株高、根长、地上部鲜重和地上部干重这4个性状的相对耐性指数构成的综合指数作为耐低钾能力的评价指标，最终筛选出11个耐低钾地方稻品种（小红早谷、迟考皮、高糯、勐选二号、白齐头谷、花谷、白香糯、红根细、冬大白、紫秆谷和冷水谷）。但这一苗期鉴定结果具有一定的局限性。为了更全面地评价这些材料的钾高效特性和产量潜力，后续还需进行大田试验鉴定，研究这些品种在不同生育期吸收利用钾的情况，并结合株高、穗长、单株产量、结实率、千粒重等主要产量性状进行综合筛选和评价，以获得更有应用潜力的钾高效水稻材料。