7株橡胶树胶孢炭疽菌拮抗放线菌的分离及拮抗活性初步评价

王 蕊，王丽娟，和桂青，侯志江，和加卫，李兆光，李 燕，和琼姬

（云南省农业科学院 高山经济植物研究所，云南 丽江 674100）

胶孢炭疽菌（Colltootrichum gloeosporioides）是半知菌类、刺盘孢属的一种真菌，是热带、亚热带国家最常见的炭疽菌总群，是炭疽属内最大的一个种群［1］。胶孢炭疽菌种类繁多，寄主范围广泛，可以侵染橡胶、香蕉、荔枝等重要的经济作物，在生长过程中引起较严重的炭疽病［2］。

胶孢炭疽菌的致病性较强，是引起橡胶树炭疽病的主要病原，而橡胶炭疽病是橡胶树常发病害之一，在橡胶的种植区分布较广［3］，对小树苗、幼树、成龄胶树都能产生危害［4］。橡胶炭疽病致使橡胶树的叶片组织大量坏死、叶片大量掉落、树体弱化，同时还会缩减割胶的时间限期，最终会导致橡胶产量的明显下滑。而且我国每年因橡胶炭疽病侵染危害的橡胶树种植面积高达2万hm²以上，由此导致了干胶产收损失近万吨，严重影响了我国橡胶产业及社会经济的发展［5］。

目前，橡胶树炭疽病的防治以化学防治为主，常选用噻菌灵等苯并咪唑类农药和咪鲜胺等麦角甾醇类生物合成制剂及其复配剂等［6］。然而，长期使用农药，易导致病害防治效果不理想并产生抗药性等问题，同时，农药会造成土壤污染及水资源污染，严重破坏生态环境［7］。生物防治因具运用便捷、高效［8］、耗能低，而且对植物本身和环境均相对安全，防治效果明显、不易导致抗药性等优点，成为如今各类植物病害绿色综合防控研究中的重点和热点［9］。

放线菌因能对许多细菌和真菌产生较强的抑制作用，常用于生物防治。放线菌在自然界中分布广泛，主要存在和分布于土壤、海洋、动植物体等多元的环境中，具有关键的生态学功能［10］。研究表明：利用土壤中的拮抗放线菌来控制植物病害发生已在众多重要经济作物病害的防治中得到广泛的研究和应用［11］。

本研究对采自甘肃省嘉峪关七一冰川的土样进行放线菌的分离，以胶孢炭疽菌等共5种病原真菌为靶标菌，对分离到的放线菌进行拮抗活性测定。旨在筛选出能产生某些抗菌物质并可用于生物防治的有益菌株，并为进一步研究和开发创新生物防治技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤来源 采自甘肃省嘉峪关的七一冰川。

1.1.2 供试植物病原真菌 胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp. cubense）、火龙果溃疡病菌（Neoscytalidium dimidiatum）、芒果蒂腐病菌（Dothiorella dominicana），均由海南大学热带农林学院提供。

1.1.3 培养基 高氏1号培养基、PDA培养基、LB培养基、小米培养基，具体配方详见文献［1］。

1.2 试验方法

1.2.1 放线菌菌株的分离与纯化 （1）土壤样品的采集。釆集土样时，先铲去表层土，挖5～10 cm深度的土壤并装入无菌牛皮纸带内，封好袋口并做好标记［12］。将采集样本带回实验室混合过筛，自然风干7～10 d后再进行分离操作［13］。

（2）土壤稀释液的制备。称取10 g土样，研磨至粉末状后，将土样粉末倒入含90 mL无菌水和少量玻璃珠的锥形瓶中，在28 ℃、160 r/min条件下振荡20 min，即成10-1浓度的土壤悬液。静置片刻后，进行梯度稀释，用移液枪吸取上层溶液1 mL至装有9 mL的无菌水试管中，混合均匀，制成10-2稀释液，依次制成10-3和10-4土壤稀释液［14］。

（3）稀释涂布法分离放线菌。取出制备好的土壤稀释液，用移液枪分别从浓度为10-2、10-3和10-4的土壤稀释液中吸取100 μL稀释液，均匀涂布于高氏1号平板上，于28 ℃条件下倒置培养7 d。

放线菌菌落的特征：不湿润、较干、小型、不透明、表面呈致密的丝绒状，上覆有一层“干粉”；菌落和培养基之间的连接较为紧密，不易挑取；菌落的正反两面通常会呈现出不同的颜色［15］。

（4）菌株的纯化。采用平板划线分离法纯化菌株。用接种环挑取平板上的单菌落分别至高氏1号培养基上进行划线分离，于28 ℃条件下培养7 d，观察菌落的生长情况，待有单菌落长出后备用。

1.2.2 拮抗放线菌的初筛 采用平板对峙法进行初筛。将分离出的放线菌以胶孢炭疽菌为靶标菌，测定放线菌的抑菌活性，具体操作如下：用接种环挑取适量放线菌，在距培养皿中心2 cm处各画一条贯穿培养皿的平行直线，再用直径为5 mm的打孔器打取胶孢炭疽菌的菌饼，接种于平板中央；以只接病原菌菌饼的平板作为对照，于28 ℃条件下培养7 d后观察，利用十字交叉法测量平板中菌落的直径，并根据公式计算抑制率［16］。计算公式如下：

1.2.3 7株放线菌对4种病原真菌抑菌活性的测定 运用1.2.2的方法，以胶孢炭疽菌为靶标菌筛选出7株拮抗活性较强的放线菌，进一步测定其对其他4种病原真菌（香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、芒果蒂腐病菌和火龙果溃疡病菌）的皿内拮抗作用。

1.2.4 7株放线菌发酵液的制备 将放线菌菌株接种于高氏1号培养基上，于28 ℃条件下培养7 d，待放线菌长出单菌落后，挑取单菌落接种于装有10 mL LB培养基的离心管中。于28 ℃、180 r/min条件下振荡培养3 d后，再按10%的接种量接种于装有100 mL小米培养基的锥形瓶中，于28 ℃、160 r/min条件下振荡培养7 d。发酵产物经12000 r/min离心5 min后得到菌体和发酵液2部分，发酵液备用。

1.2.5 7株放线菌发酵液活性的测定 取1 mL发酵液与10 mL PDA培养基（冷却至55 ℃左右）混合，倒板，以只加10 mL PDA培养基的平板作为对照，将培养5～7 d的靶标菌用打孔器打取直径5 mm的菌块，并接种于平板中央，3组重复。在28 ℃条件下培养，采用十字交叉法测定靶标菌菌落直径，根据公式（1）计算放线菌的抑制率。

1.2.6 菌株QY-26发酵液的制备及其对4种病原真菌抑菌活性的测定 制备菌株QY-26的发酵液，测定菌株QY-26对4种病原真菌（香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、芒果蒂腐病菌和火龙果溃疡病菌）的拮抗作用。方法同上。

2 结果与分析

2.1 涂布法分离放线菌的结果

通过稀释涂布法、平板划线分离法，从七一冰川土样中共分离得到28株放线菌，并依次标记为QY-1、QY-2、…、QY-28。并获得多个独立分布的单细胞［17］，为下一步试验作准备。详见图1。

图1 通过平板划线法分离出的部分放线菌

2.2 放线菌对胶孢炭疽病菌皿内拮抗活性的初筛

对分离出的28株放线菌采用平板对峙法进行初筛后，得到7株拮抗活性较显著的放线菌，编号分 别 为：QY-2、QY-8、QY-9、QY-13、QY-23、QY -26和QY-28。根据公式（1）计算，其抑制率分别为93.8%、79.3%、95.0%、41.3%、98.7%、88.8%、97.3%。其中，抑制率最高的是QY-23，其抑制率达98.7%。结果详见图2和表1。

图2 部分放线菌对胶孢炭疽病菌皿内拮抗活性初筛试验结果

表1 部分放线菌对胶孢炭疽菌的抑制率 %

2.3 7株放线菌对4种病原真菌的抑菌活性

以胶孢炭疽菌为靶标菌，初筛出抑菌活性较好的菌株为QY-2、QY-8、 QY-9、QY-13、QY-23、QY-26和QY-28。将这7株放线菌在皿内测定其对香蕉炭疽病菌、火龙果溃疡病菌、芒果蒂腐病菌和香蕉枯萎病菌这4种病原真菌的抑菌活性。结果发现：在7株放线菌中，菌株QY-2、QY-8、QY-9和QY-23对芒果蒂腐病菌的抑制率达100.0%；菌株QY-2、QY-26和QY-28对香蕉炭疽病菌的抑制率达100.0%；菌株QY-8和QY-23对火龙果溃疡病菌的抑制率达100.0%；菌株QY-28对香蕉枯萎病菌的抑制率达100.0%。综合分析，在7株放线菌中，QY-2的抑菌效果最好、抑菌谱最广，抑制率最高为98.7%，最低为96.3%；而QY-13的抑菌效果最差，抑制率最高仅为49.3%。结果见图3和表2。

表2 7株放线菌对4种病原真菌的抑制率 %

图3 部分放线菌对4种病原真菌的皿内活性测定结果

2.4 7株放线菌发酵液活性的测定

取适量发酵液制作玻片，通过显微镜观测，发现备用发酵液中有菌丝存在，可开展下一步试验操作。以胶孢炭疽菌为靶标菌，对QY-2、QY-8、QY-9、QY-13、QY-23、QY-26和QY-28这7株放线菌进行发酵液活性测定。结果发现：QY-26、QY-8、QY-13和QY-28这4株放线菌发酵液具有活性，且抑制率分别为77.8%、48.9%、6.7%和4.8%。放线菌QY-2、QY-9、QY-23的抑制率则均为0。结果详见图4和表3。

表3 7株放线菌发酵液活性的测定 %

图4 7株放线菌发酵液活性测定结果

2.5 菌株QY-26发酵液抑菌活性的测定

进一步将菌株QY-26的发酵液对香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、火龙果溃疡病菌和芒果蒂腐病菌进行活性测定。结果表明：菌株QY-26除了对胶孢炭疽菌有较好的抑制作用外，对香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、火龙果溃疡病菌和芒果蒂腐病菌也具有抑制作用，抑制率分别为77.8%、54.3%、54.0%和45.2%。结果详见图5和表4。

表4 菌株QY-26发酵液对4种病原真菌的皿内拮抗活性

图5 菌株QY-26发酵液对4种病原真菌的活性测定结果

3 结论与讨论

3.1 结论

本研究以胶孢炭疽菌为靶标菌，利用平板对峙法，对从甘肃省嘉峪关七一冰川土样中分离的放线菌进行皿内活性测定，共得到QY-2、QY-8、QY-9、QY-13、QY-23、QY-26和QY-28这7株活性较强的放线菌。进一步测定发现，这7株放线菌对香蕉炭疽病、香蕉枯萎病菌、芒果蒂腐病菌、火龙果溃疡病病菌4种病原真菌都具有抑制作用。

再以胶孢炭疽菌为靶标菌对这7株放线菌发酵液进行活性测定。结果发现：菌株QY-26、QY-8、QY-13和QY-28的发酵液具有一定抑菌活性。分析对比发现，菌株QY-26发酵液的抑菌活性最好。进一步测定发现，菌株QY-26发酵液对香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、火龙果溃疡病菌和芒果蒂腐病菌这4种病原菌具有不同程度的抑制作用。

综合发现，菌株QY-26对于5种病原菌都具有一定的抑制作用，其中对胶孢炭疽菌的抑制作用最强。

3.2 讨论

本试验在以胶孢炭疽菌为靶标菌对放线菌进行初筛时，发现菌株QY-23活性最强，抑制率高达98.7%，但其发酵液活性检测中抑制率却为0。对此推测以下可能：（1）由于放线菌时间太长而已经失活；（2）放线菌的活性物质不存在于发酵液的上清液中，而是存在于离心后的沉淀物中；（3）培养基不适合该活性物质生长；（4）传代次数过多，导致活性物减少甚至完全丧失。

本试验以放线菌为基础，通过试验总结发现，因土壤中不仅具有放线菌还有细菌，整个试验过程中常伴有细菌污染现象，对此现象的原因分析和具体有效防止措施有待研究；或对该种细菌与被污染放线菌间是否具有相同习性或之间是否具有相关联系进行试验研究；或对放线菌菌株QY-26的发酵液中活性物质进行研究，对其发酵液的沉淀物中是否含活性物质进行试验，进一步测定QY-26的抑制作用，以完善和开发其生物防治的效果，为进一步开发创新生物防治技术提供理论依据。