香叶天竺葵组培苗与扦插苗有效活性成分测定及其抗氧化活性研究

杨晓琼，何 璐，廖承飞，金 杰，袁建民，许智萍，范建成，雷 虓

（云南省农业科学院 热区生态农业研究所/元谋干热河谷植物园，云南 元谋 651300）

0 引言

香叶天竺葵（Pelargonium graveolens L’Herit.）为牻牛儿苗科（Geraniaceae）天竺葵属（Geranium）多年生芳香植物［1］。20世纪50年代初引入我国栽培［2］，现主产于云南［2］，其茎和叶中提取的香叶天竺葵精油广泛用于香水、化妆品、制药和食品工业［3］。全草可入药［4］，在民间医学中被用于治疗各种疾病，具有抗菌、抗病毒、抗氧化［5］、镇痛［6］、抗寄生虫［7］、抗结核［8］等生物活性，除药理特性外，因其抗氧化特性而被广泛应用于食品和化妆品行业［9］。对香叶天竺葵有效成分的研究主要集中于挥发性成分，其中香叶天竺葵精油挥发性成分中含量较高主要有香茅醇、香叶醇、芳樟醇等［10-11］。除了挥发性成分，香叶天竺葵中还含有总酚、黄酮、黄酮醇和缩合单宁等化学成分［1，12-13］，作为非挥发有效化学成分，黄酮类化合物具有抗炎［14］、抗氧化［15］、清除自由基［15］、提高免疫力、止痛、预防心脑血管疾病等多种药理活性；总酚化合物具有抗氧化、抗脲酶、抗酪氨酸酶和光保护作用［12］。

目前，香叶天竺葵常用的无性繁殖技术有扦插、组织培养2种方式，其中扦插为最常用的繁殖技术，具有省时、省力、操作简单、设备成本低、培育周期短等优点［16］；组织培养是一种有效的快繁方法，可以在短期内用较少的原始材料获得健康、无病的植株［16］。

国内外学者们对香叶天竺葵非精油有效活性成分及抗氧化活性进行了相关研究，但对于不同繁殖技术条件下的有效活性成分及抗氧化活性未见相关报道。袁萌芽等［4］利用乙醇、水和乙酸乙酯提取法提取了香叶天竺葵中的非精油有效活性组分，研究了非精油组分对·OH、DPPH、ONOO-和O2-等自由基、活性氧的清除能力，结果表明，乙醇、水和乙酸乙酯提取物［4］对·OH、DPPH、ONOO-和O2-的清除率明显，可以作为一种有效的自由基清除剂和天然抗氧化剂；Soukaina等［12］利用有机提取剂提取了香叶天竺葵中的非挥发总酚、黄酮、黄酮醇和缩合单宁并对其进行抗氧化、酶抑制、光保护和抗菌作用的体外研究，发现甲醇提取物具有显著的抗氧化、抗脲酶、抗酪氨酸酶和光保护作用，其中甲醇提取物的酚类化合物含量最高，且所有提取物都表现出由弱至中等的抗菌活性；Fekri等［1］研究了香叶天竺葵煎剂和浸剂中总酚的抗氧化性能、抗乙酰胆碱酯酶及抗菌活性，发现浸剂的总酚含量与煎剂的有显著差异，但均表现出较高的抗乙酰胆碱酯酶活性和对金黄色葡萄球菌较强的抗菌活性。

目前，虽然已有少量关于香叶天竺葵非精油有效成分的抗氧化活性方面的研究，但主要集中在相同繁殖技术条件下香叶天竺葵资源的活性研究方面，对扦插繁殖和组织培养繁殖的香叶天竺葵的非精油有效成分及其抗氧化活性研究未见相关报道。通过紫外-可见分光光度法、Folin-酚比色法测定香叶天竺葵组培苗与扦插苗中总黄酮、总酚含量，并对该方法进行方法学考察［14］，同时采用DPPH自由基法和羟自由基（·OH）法分析香叶天竺葵组培苗与扦插苗的抗氧化活性，筛选出最佳的繁殖技术方式，为香叶天竺葵作为天然抗氧化剂提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

香叶天竺葵供试材料来源于云南省宾川县香叶天竺葵种质资源的组培苗与扦插苗。2018年3月种植于云南省农业科学院热区生态农业研究所香叶天竺葵试验基地。经云南农业大学香料研究所任洪涛副研究员鉴定为牻牛儿苗科（Geraniaceae）天竺葵属（Geranium）香叶天竺葵（Pelargonium graveolens L’Herit.）的干燥全草，植物标本保存于云南省农业科学院热区生态农业研究所实验楼，取苗龄为2年的组培苗与扦插苗鲜样叶部位，于65～70 ℃鼓风干燥箱烘至恒重，粉碎后过40目尼龙筛，保存备用。芦丁标准品（HPLC≥98%）购自北京世纪奥科生物技术有限公司；DPPH（纯度≥98%，批号217-591-8）购自日本东京化成工业株式会社；没食子酸对照品（纯度99.8 %，批号110831）购自中国食品药品检定研究院；水杨酸（分析纯）购自上海化学试剂有限公司试剂厂；硫酸亚铁（分析纯）购自天津市风船化学试剂科技有限公司；无水乙醇（分析纯）、过氧化氢（分析纯）、碳酸钠（分析纯）、石油醚（分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；福林酚试剂（1.0 moL/L）购自索莱宝生物科技有限公司；L-抗坏血酸（维生素C）对照品购自万佳标准物质研究中心。

主要仪器设备：Spectra Max Plus 384酶标仪（美国Molecular Device公司）；UV330紫外可见分光光度计（美国热电）；Eyela 1100D旋转蒸发仪（东京理化公司）；电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；ATX224万分之一电子天平（日本岛津）；SB-5200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；UPH-IV-20T超纯水仪（中国优普）；GZX-9140MBE电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯）；粉碎机（永康市速峰工贸有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 香叶天竺葵组培苗与扦插苗非精油组分的提取 香叶天竺葵组培苗与扦插苗非精油组分的提取参照袁萌芽等［4］利用乙醇提法提取香叶天竺葵组培苗与扦插苗中非精油组分的方法进行。

1.2.2 香叶天竺葵组培苗与扦插苗总黄酮含量测定

1.2.2.1 芦丁标准曲线绘制 参考杨晓琼等［15］测定芦丁标准曲线的方法进行，稍加修改，得到芦丁在0～0.03 mg/mL浓度范围内的标准曲线回归方程为：y=11.308x+0.0005 （R2=0.9995）。

1.2.2.2 总黄酮含量的测定 分别称取组培苗与扦插苗褐色粉末提取物各25.0 mg 2份，利用70%乙醇溶液溶解，配制成2.5 mg/mL的溶液定容至10 mL的棕色容量瓶中，分别取1.0 mL样品液于50 mL棕色容量瓶中，其余步骤与1.2.2.1芦丁标准曲线的制定方法相同，进行3次重复，计算组培苗与扦插苗样品中总黄酮的平均含量。

1.2.2.3 香叶天竺葵组培苗方法学考察 以香叶天竺葵组培苗为方法学考察的试验对象，分别开展以下试验：（1）稳定性考察，将香叶天竺葵组培苗按1.2.2.2方法制备样品，取1.0 mL样品液于50 mL棕色容量瓶中，其余步骤与1.2.2.1芦丁标准曲线的制定方法相同，每隔1 h测定1次吸光度值，共测6次。（2）精密度考察，方法同（1），分别进行5次测定。（3）重复性考察，取香叶天竺葵组培苗样品6份，按1.2.2.2方法制备样品，分别取1.0 mL样品液于50 mL棕色容量瓶中，其余步骤与1.2.2.1芦丁标准曲线的制定方法相同，测定6份样品的吸光度值。（4）回收率考察，精密称取香叶天竺葵组培苗样品粉末0.1 g 9份，分为3组，向每组样品中分别加入样品含量的50%、100%和150%的芦丁标准品溶液，按1.2.2.2方法制备样品，分别取1.0 mL样品液于50 mL棕色容量瓶中，其余步骤与1.2.2.1芦丁标准曲线的制定方法相同，并测定510 nm处的吸光值，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。

1.2.3 香叶天竺葵组培苗与扦插苗总酚含量测定

1.2.3.1 没食子酸标准曲线的绘制 参考王兴瑞等［17-18］的研究方法，稍加修改，得到没食子酸在0～0.036 mg/mL浓度范围内的标准曲线回归方程为：y=30.19x+0.0033 （R2=0.9991）。

1.2.3.2 总酚含量的测定 分别称取组培苗与扦插苗褐色粉末提取物各25.0 mg 2份，利用70%乙醇溶液溶解，配制成1 mg/mL的溶液定容至25 mL棕色容量瓶中，采用Folin-酚比色法，取0.3 mL的样品液于10 mL棕色容量瓶中，其余步骤与1.2.3.1没食子酸标准曲线的制定方法相同，进行3次重复，通过标准曲线计算组培苗与扦插苗样品中总酚的平均含量。

1.2.3.3 香叶天竺葵组培苗方法学考察 同理，以香叶天竺葵组培苗为方法学考察的试验对象，参考1.2.2.3的方法对香叶天竺葵组培苗进行方法学考察，稍加修改。

1.2.4 香叶天竺葵组培苗与扦插苗抗氧化活性研究1.2.4.1 DPPH自由基清除率测定 参照王彦兵［19］、Soukaina［12］等的研究方法，选用L-抗坏血酸作阳性对照，稍加修改。根据公式（1）计算DPPH自由基清除率：

公式（1）中，Ai为样品溶液吸光值，Aj为无水乙醇代替DPPH溶液的对照组吸光值，Ac为纯水代替样品溶液的空白组吸光值。

1.2.4.2 羟自由基清除率测定 参照黄秋萍等［20］的研究方法，稍加修改，选用L-抗坏血酸作阳性对照。根据公式（2）计算羟自由基清除率：

公式（2）中，A为样品溶液吸光值，A1为纯水代替过氧化氢溶液的对照组吸光值，A0为纯水代替样品溶液的空白组吸光值。

1.2.5 统计分析 利用Origin 8.6、SPSS 21.0和Excel 2016软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

2.1.1 总黄酮含量测定方法学考察结果 （1）稳定性试验结果显示，供试品放置5 h内的RSD为1.15%，小于2%，表明供试品溶液在制备显色5 h内稳定。（2）精密度试验结果显示，5次试验测得香叶天竺葵总黄酮含量分别为0.931%、0.909%、0.909%、0.893%、0.909%和0.893%，平均值为0.907%，相对标准偏差（RSD）=1.54% （n=6），说明仪器精密度良好。（3）重复性试验结果显示，香叶天竺葵组培苗样品中总黄酮的平均含量为0.911%，RSD=1.87% （n=6），表明该总黄酮含量的测定方法重复性较好。（4）由样品平均加标回收试验结果显示（表1），样品的平均加标回收率为97.30%，RSD为1.29%，说明回收率良好。

表1 香叶天竺葵组培苗加标回收率考察结果

2.1.2 总酚含量测定方法学考察结果 （1）稳定性试验结果显示，供试品放置3 h内的RSD为1.30%，表明供试品溶液在制备显色3 h内稳定。（2）精密度试验结果显示，测得香叶天竺葵总酚含量分别为1.125%、1.118%、1.145%、1.145%、1.152%和1.152%，平均值为1.140%，RSD=1.27% （n=6），说明仪器精密度良好。（3）重复性试验结果显示，测得的香叶天竺葵组培苗样品中总酚的平均含量为1.124%，RSD=1.86%（n=6），表明该总酚含量的测定方法重复性较好。（4）由样品平均加标回收试验结果（表2）可知，样品的平均加标回收率为97.94%，RSD为0.58%，说明回收率较好。

表2 香叶天竺葵组培苗加标回收率考察结果

2.2 香叶天竺葵组培苗和扦插苗总黄酮、总酚含量测定结果

由表3可知，不同繁殖技术条件下，香叶天竺葵组培苗总黄酮（0.911%）与扦插苗总黄酮（0.86%）含量无显著差异，但组培苗中总酚含量（1.124%）显著高于扦插苗总酚含量（0.92%），且总酚含量均高于总黄酮含量，说明繁殖技术方式对总黄酮含量的影响较小，但对其体内总酚成分的合成与积累可能具有一定影响。

表3 香叶天竺葵组培苗与扦插苗中总黄酮、总酚含量的测定结果

2.3 香叶天竺葵组培苗和扦插苗的抗氧化活性比较结果

不同繁殖技术条件下香叶天竺葵对DPPH、羟自由基清除能力的曲线方程、相关系数及半抑制浓度（IC50）如表4所示。根据IC50值来评价组培苗和扦插苗有效成分清除DPPH和羟自由基能力的强弱，IC50值越小，清除能力就越强［14］。

表4 组培苗与扦插苗对DPPH、羟自由基清除能力的曲线方程、相关系数及IC50

2.3.1 DPPH自由基清除能力测定结果 由表4可知，组培苗和扦插苗有效成分清除DPPH自由基的IC50分别为16.72和18.86 µg/mL，相关系数分别为0.9911、0.9901，组培苗对DPPH自由基的清除率高于扦插苗，这和上述组培苗中总酚含量高于扦插苗是一致的，因为总酚化合物具有抗氧化、清除自由基的功效［12］，总酚含量与自由基的清除效果呈正比例关系。组培苗、扦插苗有效成分和L-抗坏血酸对DPPH自由基的清除率如图1所示。由图1可知，DPPH自由基的清除率随组培苗、扦插苗有效成分和L-抗坏血酸质量浓度的增加呈上升趋势，质量浓度为30 µg/mL时，清除率分别为82.3%、76.9%、96.5%，其中L-抗坏血酸对DPPH自由基的清除率的抑制方程为：y=4.0357x+25.781（R2=0.9907），IC50=5.63 µg/mL，由IC50值可看出组培苗和扦插苗有效成分对DPPH自由基的清除率是L-抗坏血酸的33.6%和29.8%，说明组培苗和扦插苗有效成分均对DPPH自由基具有清除效果，但清除效果显著低于L-抗坏血酸，这可能是因为利用乙醇法提取的组培苗和扦插苗中有效成分未完全浸出，且纯度较低的缘故［19］。

图1 香叶天竺葵组培苗与扦插苗对DPPH自由基 清除率的比较

2.3.2 羟自由基（·OH）清除能力测定结果 羟自由基是一种能快速进行多种生化反应的自由基，氧化能力极强，会导致人体多种病变的产生，通过测试天然产物对羟自由基的清除效果，可作为一种表征天然产物的抗氧化活性的手段［20］。从表4可知，组培苗和扦插苗有效成分清除羟自由基的IC50分 别 为443.92和467.92 µg/mL，相 关 系 数分别为0.9940、0.9916，组培苗对·OH的清除率高于扦插苗。组培苗、扦插苗有效成分和L-抗坏血酸对·OH的清除率如图2所示。由图2可知，组培苗、扦插苗有效成分和L-抗坏血酸对·OH的清除率与质量浓度呈正相关，浓度越大清除效果越显著。在最大浓度500 µg/mL时，组培苗、扦插苗和L-抗坏血酸的清除率分别为57.5%、53.7%、90.7%，其中L-抗坏血酸对·OH的清除率的抑制方程为：y=0.1901x-7.834 （R2=0.9902），IC50=304.88 µg/mL，由IC50值可看出组培苗和扦插苗有效成分对·OH的清除率是L-抗坏血酸的68.7%和65.2%，说明组培苗和扦插苗有效成分均对·OH自由基具有清除效果，但清除效果低于L-抗坏血酸，可能是因为利用乙醇法提取的扦插苗和组培苗中有效成分未完全浸出，且纯度较低的缘故［19］。

图2 香叶天竺葵组培苗与扦插苗对羟自由基清除率的比较

3 讨论

本研究通过利用紫外-可见分光光度法、Folin -酚比色法测定香叶天竺葵组培苗与扦插苗中总黄酮、总酚含量，研究结果发现，组培苗总黄酮含量（0.911%）和扦插苗总黄酮含量（0.860%）无显著差异，组培苗中总酚含量为1.124%，显著高于扦插苗总酚含量（0.92%），且总酚含量高于总黄酮含量，说明繁殖技术方式对总黄酮含量的影响性较小，但对其体内总酚成分的合成与积累可能具有一定影响。香叶天竺葵组培苗和扦插苗总黄酮含量与袁萌芽等［4］利用醇提法提取香叶天竺葵总黄酮含量（0.93%）相比，相差不大。但组培苗中总酚含量为1.124%显著高于袁萌芽等［4］的香叶天竺葵总酚含量（0.93%），与扦插苗总酚含量（0.92%）差异显著，说明有效活性成分总黄酮、总酚含量可能受气候、地域、品种、繁殖方式、提取方法等的影响［21］，其含量会存在一定的差异，但利用组培的繁殖技术方式更有利于有效活性成分的积累。

对组培苗和扦插苗有效成分进行抗氧化活性评价，结果表明香叶天竺葵组培苗对DPPH自由基和·OH的清除率均高于扦插苗（组培苗清除DPPH自由基和·OH的IC50分别为16.72和443.92 µg/mL，扦插苗分别为18.86和467.92 µg/mL）。与袁萌芽等［4］利用香叶天竺葵非精油组分醇提物对DPPH的清除能力（清除DPPH的IC50分别为17.08 µg/mL）相比，组培苗清除DPPH自由基的能力更强，说明采用组培的繁殖方式具有更强的自由基清除能力，这和上述组培苗有效活性成分含量较高相协调的，因为有效活性成分含量与自由基的清除能力成正比。Soukaina等［12］利用香叶天竺葵醇（甲醇）提取物和己烷提取物研究清除DPPH的清除能力，发现甲醇提取物和己烷提取物清除DPPH自由基和·OH的IC50分别为12.96和37.60 µg/mL，说明利用醇提物清除DPPH自由基的能力更强，尤其是利用甲醇作为提取物，对DPPH自由基的清除能力明显提高，但甲醇有一定毒性，对人体易造成伤害，改用乙醇作为提取剂，安全无毒且可回收利用［22］，所以本研究选择利用乙醇提取香叶天竺葵中有效活性成分。研究中还发现，组培苗和扦插苗的抗氧化能力随有效成分质量浓度的增加而增强，这与张福平［23］、赵国超等［14］研究发现有效成分的抗氧化能力随其质量浓度的增加而增强的结果一致。

天然产物中提取的有效活性成分具有抗氧化作用，天然抗氧化剂相比于合成抗氧化剂［24］，具有活性强、毒性小的优势［24］，当2种或多种有效活性成分共同使用时，因存在协同作用，抗氧化活性更强，本研究中香叶天竺葵组培苗和扦插苗同时含有总黄酮和总酚2种抗氧化活性成分，因此，本研究中对DPPH自由基和·OH的清除作用可能是总黄酮与总酚协同作用所产生的。过量自由基会引发各种疾病，如心脑血管疾病、肿瘤等［25］，同时还会加速人体衰老，天然抗氧化剂具有清除自由基的功效，因此，从植物中提取的抗氧化剂在食品、医药及材料等研究领域具有较大的应用前景［25］。目前，由于体内活性试验存在耗时长、成本高等不足，抗氧化活性物质的筛选主要集中于体外模拟测试试验［26］，本研究也是利用体外进行抗氧化活性研究。

本研究结果表明，组培苗和扦插苗有效成分对DPPH自由基和·OH具有清除作用，且清除率与质量浓度呈正比例关系，但其清除效果均低于L-抗坏血酸，这可能是因为试验所用的香叶天竺葵有效成分的纯度不高，掺有一定量的杂质，从而影响多酚类物质的共轭结构以及有效成分之间的协同作用［19］。组培苗有效成分对DPPH自由基和·OH清除能力的IC50分别为16.72和443.92 µg/mL，分别是L-抗坏血酸清除能力的33.6%和68.7%；扦插苗的IC50分别为18.86和467.92 µg/mL，分别是L-抗坏血酸清除能力的29.8%和65.2%，试验结果说明，香叶天竺葵组培苗和扦插苗具有一定的抗氧化活性，但对不同自由基清除能力存在差异，这主要是由多酚类化合物结构所决定。多酚类化合物通过单电子转移和氢原子转移直接清除自由基［27］，或通过化合物的羟基位置和数量直接影响抗氧化活性［28］，而组培苗的抗氧化活性强于扦插苗，因此，在产业化种植的情况下可以考虑选择组培的方式进行繁殖，不仅清除自由基的能力较强，而且组培苗具有抗性强、次生代谢物含量增加、不易致病害等优势，这和易清元等［29］的香叶天竺葵多倍体（组培苗）苗研究结果一致。本研究对不同繁殖技术条件下的香叶天竺葵进行了抗氧化活性研究，但抗氧化活性评价因素较少，未能确定香叶天竺葵中起抗氧化作用的具体有效单体成分，因此，下一步将对超氧阴离子自由基、ABTS自由基等还原能力进行考察，同时分离和纯化香叶天竺葵组培苗和扦插苗有效单体成分，最终确定香叶天竺葵中的生物活性成分。

4 结论

本研究对香叶天竺葵的组培苗和扦插苗进行了抗氧化活性研究，建立的香叶天竺葵中总黄酮和总酚含量测定方法操作简单、快捷，具有良好的稳定性、线性、重复性、精密度和回收率。香叶天竺葵的组培苗具有较强的抗氧化活性，所以在繁殖香叶天竺葵时可采用组培的方式进行繁殖，同时香叶天竺葵的有效活性成分可作为天然抗氧化剂进行开发，在化妆品、药品和食品等方面具有一定的开发利用前景。