组学技术在中医药防治重症肌无力中的应用进展*

冯雨菡，张运克，2

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046； 2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种获得性自身免疫性疾病，由乙酰胆碱受体抗体(anti-acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介导、细胞免疫依赖和补体参与，从而导致神经、肌肉接头的传递功能出现障碍，具体表现为骨骼肌收缩无力[1-2]。乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AchR)抗体一直是MG最常见的致病性抗体，但随着近些年对MG研究的深入，发现肌肉特异性受体酪氨酸激酶(muscle specific receptor tyrosine kinase，MuSK)抗体、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(low density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4)抗体以及兰尼碱受体(ryanodine receptor，RyR)抗体对MG的发病同样发挥着作用，这些抗体能干扰乙酰胆碱受体的聚集、影响神经肌肉接头的信号传递和功能，从而导致MG的发病。MG患者全身骨骼肌均可受累，活动后症状加重，休息后较前减轻，临床以眼外肌受累最为常见，多表现为上睑下垂、复视，其他肌群受累表现为咀嚼无力、饮水呛咳、苦笑面容、鼓腮漏气、抬头困难等症状，发病早期症状多为一组肌群出现无力，逐渐累及全身[3]。研究发现，MG的患病率为每10万居民400～1 800例，发病率为每10万居民40～120例[4]，且随血清学的普及呈递增趋势。目前，MG的治疗主要以胆碱酯酶抑制剂、免疫抑制剂、静脉注射免疫球蛋白、血浆置换和胸腺切除为主，胆碱酯酶抑制剂和肾上腺皮质激素是目前应用最为广泛的一线药物。目前，西药治疗MG可有效改善患者临床症状，但面临的问题也极为突出，相关药物缺乏统一标准，多依靠临床经验给药，且一些药物存在较为严重的不良反应，如糖皮质激素的应用会产生肥胖、高血压、高血糖、骨质疏松等不良反应，且易产生激素依赖。因此，深入探索MG的发病机制，寻找更为安全有效的治疗方法刻不容缓。

中医学无“重症肌无力”的说法，根据其临床症状，可将其归属于“痿证”的范畴。中医对“痿证”的认识最早源于《黄帝内经》[5]，《素问》提出了“治痿独取阳明”的治疗原则。MG的肌无力症状在全身多处骨骼肌均可发生，其乏力的临床表现与气虚密切相关。中医认为，脾主运化，主肌肉，认为该病与脾具有较为紧密的联系。《黄帝内经》所载：“脾主身之肌肉，肾主身之骨骼……脾气热，则胃干而渴，肌肉不仁，发为肉痿；肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”认为MG的发病与脾胃及肾有关。目前，多数医家认为本病病位主要在脾肾，根本病机为先天不足或后天失调，导致脾肾亏虚、精失所养、气血不足、肢体肌肉失养等以虚损为主的症状[6-9]。MG的证型较为分散多样，不同专家根据其临床经验得出的辨证分型亦不同。吕志国等[10]通过专家共识法，将该病证型最终确定为脾肾两虚证、脾胃气虚证、气阴两虚证、大气下陷证4个证型，认为本病的根本病机为脾肾亏虚，以健脾益气、补脾益肾为基本治则。双晓萍等[11]通过分析近30年发表的相关文献，发现多数医家临床治疗MG应用最多的方剂依次为补益剂、祛湿剂、补阳剂，应用频率最高的中药为黄芪。最近的一项Meta分析系统评价了补中益气汤联合西药治疗MG的疗效和安全性，认为中药方剂联合西药较单纯西药治疗效果更好，且不良反应小，安全性高[12]。杨士杰[13]研究发现，补中益气汤加减联合免疫抑制剂的有效率明显高于基础西药组，比较两组治疗18个月后的数据，发现前者的CD4+CD25+Treg细胞比显著升高，AchRAb水平显著降低，提示补中益气汤加减联合免疫抑制剂治疗MG疗效更好，不良反应更小。有学者经系统评价发现，相比于单纯西药治疗MG，中西医结合治疗在改善患者临床症状方面更具优势，且能够有效降低复发率，提高有效率[14-15]。综上，中西医结合治疗MG较单纯西药更具优势，亟须进行更为深入的探索。目前，中医药已被广泛应用于MG的治疗，具有价廉、方便、疗效好、不良反应少等优势[16]。

组学技术基于系统生物学产生，其发展亦会对系统生物学产生影响。组学技术多样，基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白质组学、免疫组学、脂类组学、糖组学等[17]均属于组学技术的范畴，其中基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学发展较早，运用广泛，被称为“四大组学技术”，对于人体生理病理机制的研究而言意义重大。组学技术可有效改善中医药作用靶标和机制不明的问题，而多组学技术联合可更好地阐明疾病作用机制，使中医药迅速准确地找出治疗疾病的生物标志物，科学评估临床价值[18]。此外，组学技术具有高通量特点，可为MG发病潜在的分子机制和信号通路提供新的研究方向，为发现新的治疗靶点提供依据，加速对MG治疗的研究步伐。目前，已有研究发现了一些具有参考价值的MG生物标志物及靶标。

1 四大组学技术

1.1 蛋白质组学蛋白质组学出现较早，主要从蛋白质的表达水平、翻译后修饰、亚细胞定位或迁移、蛋白与蛋白相互作用等方面进行研究[19]。该技术在MG中应用广泛，研究方法多样，包括双向凝胶电泳、荧光差异凝胶电泳、同位素亲和标记、同位素标记相对和绝对定量技术、非标记定量技术等方法。蛋白质组学能从蛋白质水平深入认识疾病，筛选出与相关的蛋白质标志物和潜在的治疗靶点，为进一步认识疾病的作用机制并找出新的有效的治疗方法提供思路。

蛋白质组学在中医药领域中的应用相当广泛，它能进一步补充中医证候的诊断标准；找出中药或复方制剂的作用靶点和机制，并对方药中各中药“君臣佐使”的配伍原则作出阐释等[20-25]。蛋白质组学在蛋白质的表达、结构和功能等方面有其独特的研究方法，主要研究整体的蛋白质活动并找出其规律，这与中医整体观念和辨证论治思想高度一致。蛋白质组学具有的整体性、动态性、稳定性等特点，与中医学证候的整体观、恒动观相通，说明蛋白质组学在中医证候本质的研究中具有较大优势[26]。同时，疾病的发生发展过程、同病异治和异病同治的辨证施治以及中药(复方)对机体调节的方式也是多环节、多靶点、多成分、多通路的整体协同过程[27]。

1.2 基因组学基因组学技术能够研究基因组的表达、多样性和功能，它在生物体内所有基因水平上分析核苷酸序列及基因功能。在基因组这一水平上的研究，不仅包括碱基序列的组成及变化，还包括DNA甲基化、染色质修饰等非序列变化引起的基因表达水平的变化[28]。现在常用的基因组学技术有定量分析技术(实时荧光PCR)、高通量技术(基因芯片、测序)等；测序技术包括宏基因组测序、全基因组重测序、全基因组Bisulfite测序、外显子组测序、目标区域测序、Me-DIP测序、RRBS测序等[29]。

基因组学在中医药领域中的应用多样，它能说明基因的多态性和中药之间的联系；对中医的经络、穴位等方面作出补充，并解释其作用机制；建立中医“证候”表达谱等[30-33]。基因组学同样具有整体性和稳定性的特点，这与中医证候方面的特性不谋而合，它能进一步明确中医证候的物质基础，准确、客观地阐明疾病的发生发展规律，让我们对疾病的认识更加深入。

1.3 转录组学转录组学可应用于研究细胞在某一功能下所含mRNA的类型与拷贝数，发现不同功能状态下mRNA表达的不同，从而找出与功能状态变化联系紧密的重要基因群[34]。转录组学主要有基因表达序列分析、基因芯片、表达序列标签、cDNA-AFLP等[35]。

转录组学在中医药领域中的应用独具特色，能够鉴别中药材真假和中药次生代谢产物生物合成功能基因，找出中药及复方的作用靶点与机制，对中医的证候诊断标准进一步完善[36-37]。转录组学能研究特定条件下细胞内基因的转录和调控[38]，这一思想与中医的整体观念高度一致。从转录水平研究中医证候相关基因的转录调控，有助于建立中医证候的生物学基础，为中医证候的规范化和现代化提供依据。

1.4 代谢组学代谢组学较基因组学、转录组学、蛋白质组学等组学技术而言，出现较晚，主要通过信息建模、系统整合等手段研究生物体代谢物中的动态变化，从而发现其规律[39]。代谢组学主要技术有核磁共振技术、液相色谱质谱联用、气相色谱质谱联用、毛细管电泳质谱联用、同位素标记质谱等。近年来，代谢组学发展迅速，在疾病诊断、药物研发及相关毒理研究等领域均有广泛的应用前景[40]。

代谢组学在中医药领域中的应用较为广泛，能对中药材质量进行评价、发现中药复方中各个药物配伍的机制和规律、探索中药治疗疾病的作用机制、找出相关疾病的代谢生物标志物、建立中医证候代谢组等[41-44]，从而有效推动中医药领域的发展。代谢组学研究将整体与微观研究相结合，由于其较强的综合信息优势，与中医整体观、系统观相符[45-47]，已被广泛应用于中医药相关研究。华何与等[48]梳理了近年来中医药领域中应用代谢组学的文献，认为在以中医药治疗疾病的过程中，生物体内会发生代谢物量和性的变化，而代谢组学可将其表现出来，若将代谢组学与中医证型相结合，可进一步推动中医药现代化研究。

2 组学在MG中的应用进展

2.1 蛋白质组学蛋白质组学已在许多研究中被应用于MG发病机制和诊断治疗的研究。Zhang等[49]运用同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation techniques，iTRAQ)技术对补中益气汤治疗MG患者的血浆差异蛋白质进行筛选，鉴定出618个蛋白质，发现加味补肾汤可能通过调节某些重要蛋白的表达而发挥治疗MG的作用，确定了其潜在的生物标志物，对MG的发病机制加深了认识。宋文集等[50]以双向凝胶电泳技术对脾胃虚损型MG患者与正常人的骨骼肌蛋白进行分离，在实验组脾胃虚损型MG患者与对照组患者骨骼肌中共找到27个差异蛋白，对其中选择比值较大的15个蛋白质点进行鉴定，共鉴定出10个蛋白，发现影响MG的发病机制有很多，与肌细胞结构蛋白表达变化、线粒体能量代谢障碍、钙通道以及氧自由基等均有关联。

2.2 基因组学Xi等[51]利用肿瘤基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库中11个胸腺瘤相关MG和10个非MG胸腺瘤的RNA测序数据计算其差异表达基因，最终用实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)检测到sBTLA、CCR7、TNFRSF25和ANKRD55的过度表达，可以部分解释胸腺瘤相关MG的发病机制。Nel等[52]利用全基因组测序确定了眼肌型MG的候选易感基因HLA-DPA1和HLA-DPB1。张荟雪等[53]研究发现，MG的发病与其易患基因及多态性有关，可在基因及遗传水平上对MG的发病机制进行研究，以找出更为有效的治疗方法，为MG的药物治疗提供新靶点。中医辨证论治的重点为“同病异治”与“异病同治”，运用何种治疗方式并非取决于疾病，而是取决于“证候”。Wu等[54]从基因水平观察到阳虚证、阴虚证患者在PPARD、PPARG和APMI 3个基因的单个单核苷酸多态性和单倍体上有显著差异。党照丽[55]发现肾虚质与免疫关系密切，应用基因芯片技术分析比较了肾虚质大鼠、正常质大鼠及应用补肾药物后肾虚质大鼠脾脏淋巴细胞免疫相关差异表达基因谱，筛选出免疫相关差异表达的基因进行研究，发现补肾中药能有效改善肾虚质，可能是通过调控某些基因的表达而发挥作用。

2.3 转录组学Park等[56]报道了一项使用RNA测序的初步血液转录组研究，发现28个差异表达基因可能与MG疾病活动有关，表明参与细胞运输和凋亡的基因的转录丰度谱可能是MG患者疾病活动的分子标志。Jiang等[57]利用Solexa测序技术，在阴虚热证患者和健康对照者之间进行转录组学研究，鉴别了反映阴虚热证特征的差异表达mRNAs，揭示其潜在的生物学机制，为同证型MG的探索提供了思路。黄攀等[58]研究发现，MG患者的血清中存在高表达的miR-126和低表达的Foxp3 mRNA，其中高表达的miR-126可在一定程度上抑制Foxp3的表达，导致MG的发病。

2.4 代谢组学Lu等[59]使用基于LC-MS的血清代谢组学方法结合多变量统计分析，对不同类型的MG患者进行鉴别和分类，应用液相色谱-傅立叶变换质谱对42例MG患者和16例健康志愿者的血清样本进行分析，观察到早期和晚期MG患者之间代谢谱变化不同，并鉴定出9种生物标志物，包括γ-氨基丁酸和1-磷酸鞘氨醇。Blackmore等[60]为了识别MG特有的生物标志物，运用双对照、多标记代谢组学分析方法，最终在血清呈阳性的MG患者中发现，表明代谢组学技术能够将MG患者和非MG患者进行区分。陈银芳等[61]研究发现，大鼠体内有5种代谢产物在服用补气药前后存在差异，这些代谢差异物均与能量代谢有关，为补气药干预气虚证的作用机制研究提供了生物学基础。黄张杰等[62]为了探索补中益气汤对脾气虚证大鼠尿液代谢表型变化的影响，运用代谢组学技术，发现补中益气汤对脾虚证大鼠的氨基酸代谢、脂质代谢和能量代谢水平均有调节作用。上述研究表明，代谢组学在MG的检测和分级、发现疾病生物标志物、发现中药作用物质基础方面具有较大潜力。

3 思考与展望

组学概念的提出以及组学技术的应用，为中医药研究提供了新的方法，找到了新的方向。组学是一个由整体理念产生的概念，它与中医药的内涵相吻合，其性质也与中医药的整体思路一致。生物标志物在现代医学治疗MG的过程中起到辅助诊断、评价疗效和预后的作用。研究表明，蛋白质组学能够通过中药方剂检测出MG生物标志物及潜在的治疗靶点；转录组学能够通过揭示潜在生物学机制为阴虚证MG的探索提供思路；基因组学发现，某些中药能通过调控基因表达发挥对肾虚质大鼠的治疗作用，从而探索出同证型MG的治疗方法；代谢组学在发现中药作用物质基础方面具有较大潜力。然而，总结以上研究仍能发现其存在一些不足之处：①组学技术对中医药的研究大部分停留在证候层面，临床研究过少。②组学技术对于MG的研究大部分停留在西医方面，中医药治疗MG的研究较少。因此，今后应加深对MG发病机制的认识，探索中医药辨证治疗MG的机制阐释、证候诊断，通过组学技术进一步发现中医药对MG生物标志物及潜在治疗靶点的作用，探索中医药对MG患者中医证候的作用，以中药干预临床试验并进行疗效评价，为中医辨证治疗MG提供更多依据。