超声造影联合免疫组织化学诊断小肝细胞癌微血管侵犯：两个医院的回顾性研究

王斐倩 沼田和司 阮骊韬 中野雅行 白晓旭 刘钰鑫 曲凯

作者单位：710061 西安 1西安交通大学第一附属医院超声医学科；232-0024 横滨 2日本横滨市立大学附属市民综合医疗中心消化器病中心；92-0024 东京 3日本东京都中央区中央病理实验室；710061 西安 西安交通大学第一附属医院4肝胆外科，5生物样本信息资源中心

微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）被公认为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）切除术后复发常见的危险因素，甚至被认为是导致复发的唯一或最重要的危险因素［1］。HCC的MVI发生率为15.0%～57.1%［2］，存在MVI的患者3年无复发生存率从62.5%降至27.7%［3］。HCC手术治疗（包括肝切除术、射频消融术等）前及早发现MVI对临床决策，如手术方式（是否考虑术后辅助治疗）和切除范围（对存在MVI的病灶采取＞1 cm的宽手术切缘）的规划具有重要的指导意义［4-5］。已有研究显示，针对MVI阳性的HCC患者，采用解剖性肝切除或经动脉化疗栓塞、射频消融等局部联合治疗可降低肿瘤复发率［6-7］。MVI诊断的金标准是在显微镜下、于肿瘤周围可见血管内皮细胞衬覆的癌细胞巢团（以癌旁门静脉分支为主），且没有肉眼可见的肿瘤血管侵犯［8］。由于MVI诊断对标本完整性有一定要求（包含癌旁组织），因此无法使用肝癌穿刺活检标本，而是使用手术切除后的标本进行MVI诊断［9］。这一特点导致MVI诊断通常是在手术后完成，因此具有显著滞后性［10］。开发术前准确诊断MVI的方法将有助于外科医师制定更完善的手术规划，同时可将系统治疗前置，以进一步降低肿瘤复发率。

超声造影（contrast enhanced ultrasound，CEUS）因实时性、无创性、无放射性、造影剂过敏反应低、诊断结果可以立即获得、价格低廉、易操作、可重复使用等优点而被日本的肝癌治疗指南推荐为肝癌高危人群的筛查工具［11］。此外，近年发展起来的第二代新型超声造影剂示卓安®（Sonazoid®）有独特的血管后期（post-vascular phase，PVP），可延长造影后期的观察时间，大大增加了诊断信息［12］。鉴于CEUS在诊断HCC中的重要价值，近年来已有研究尝试将CEUS从诊断HCC扩展到应用于诊断MVI并取得了一些有意义的结果。例如，存在MVI的病灶边缘区域和周围肝实质的造影剂浓度/时间速率在造影剂进入和洗脱时都表现出统计学差异［13］。还有研究显示，动脉期（arterial phase，AP）癌旁的造影剂高灌注是MVI发生的独立危险因素［14］。然而，目前有关CEUS诊断MVI的研究大多围绕肿瘤形态及造影剂弥散特征而展开，且仍然存在假阳性率高等局限性。因此，如何进一步提高CEUS的MVI诊断效率，是当前亟需突破的难点问题。

现有研究显示，表达特异性分子标志物的HCC患者MVI阳性比例明显升高。JEON等［15］研究发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican 3，GPC3）表达阳性的HCC患者比GPC3阴性患者更易发生MVI。热休克蛋白 70（heat shock protein 70，HSP70）的表达水平与HCC患者的组织学分级、肿瘤的间质侵袭以及新生血管有关［16-17］。免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）法只需观察癌细胞有无染色即可，因此降低了病理阅片难度，减少了读片时间，理论上也能降低不同操作者之间的误差。更重要的是IHC不需在肿瘤交界处多位点取材以观察癌旁微血管，穿刺活检取得的少量标本即可获得诊断。因此，本研究尝试利用术前的穿刺活检标本进行GPC3和HSP70染色，同时结合CEUS的AP和PVP癌旁灌注情况，探讨以上指标单独和联合诊断HCC的MVI的效能，以期寻找MVI的术前最佳诊断策略。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性收集2017年1月至2019年12月来自日本横滨市立大学附属市民综合医疗中心和同时期西安交通大学第一附属医院共419例HCC患者的1 029个病灶。纳入标准：⑴成年患者（≥18岁）；⑵均依次实施CEUS、穿刺活检、手术切除；⑶经组织病理学金标准明确诊断有无MVI。排除标准：⑴Child-Pugh分级为C级（56例，253个）；⑵CEUS、穿刺活检、切除术其中之一缺失（140例，384个）；⑶CEUS、穿刺、手术切除间隔超过1个月（37例，69个）；⑷手术标本的组织病理学未能明确MVI的诊断（6例，9个）；⑸经过治疗后的病灶（10例，62个）；⑹病灶最大直径＞3 cm（28例，75个）。经过上述筛选后，本研究纳入142例HCC患者共177个病灶，其中包含23例患者的37个MVI阳性病灶和119例患者的140个MVI阴性病灶。本研究经日本横滨市立大学医学中心的伦理审查委员会（编号：B180200054）和西安交通大学医学部生物医学伦理委员会（编号：2021-461）批准，符合赫尔辛基宣言的原则。本研究为回顾性研究，故豁免患者知情同意书。

本研究凭借手术切除获得标本并在镜下进行有无MVI诊断作为诊断MVI的金标准。通过回顾性检索电子病历系统、影像学图文报告系统获得患者的一般临床特征（包括年龄、性别、肝炎病史、Child-Pugh分级）和病灶的一般特征（包括病灶大小、所属肝脏节段），通过检索病理系统中的穿刺标本信息获得IHC诊断信息。曾实施术前穿刺活检的患者（病灶）主要来源于HCC诊断证据不足（例如甲胎蛋白未见明显升高以及缺乏典型影像学特征等），或患者同时期进行其他临床研究且要求手术切除的病灶术前已进行穿刺活检（HCC诊断需组织病理学诊断明确）。

1.2 CEUS检查方法

采用配有CEUS功能的LOGIQ E9超声诊断系统（GE，美国），凸阵探头频率为2～5 MHz，机械指数为0.2～0.3。日本横滨市立大学附属市民综合医疗中心患者的CEUS操作由1名工作5年的超声技师和1名工作20年的消化科医师协作完成；西安交通大学第一附属医院患者的CEUS操作由2名工作5年以上的超声科医师协作完成。患者取仰卧或侧卧位，给予肘正中静脉弹丸式注射0.2 mL示卓安®微泡混悬液，然后立即静脉推注2 mL 5%葡萄糖；分别在注射造影剂后10～30 s的AP及10 min后的PVP观察病灶较周围同深度肝脏实质组织的造影剂灌注情况，判断为低灌注或等灌注（图1）。若病灶因位置过深、肝硬化背景等原因显示欠清晰，则采用高机械指数成像或在PVP再次注射造影剂进行观察［12］。

1.3 穿刺活检及IHC检查

采用超声引导下经皮经肝细针穿刺抽吸术，以21G活检针（SONOPSY，日本）于癌灶处获取至少2条组织标本。所有组织均经福尔马林固定、石蜡包埋、连续等厚（3～4 μm）切片，采用HSP70和GPC3的抗体进行IHC染色，显微镜下观察。HSP70阳性指肿瘤细胞的细胞核、细胞浆被染色，GPC3阳性指肿瘤细胞的细胞浆和细胞膜被染色，以超过5%的细胞被染色定义为阳性（只进行有无染色判断，不考虑染色强度），见图1。由1名实验员在不知晓患者临床、实验室、影像学检查等信息的前提下记录染色结果。

图1 发生MVI的1例HCC病灶的CEUS和病理图片Fig.1 Contrast-enhanced ultrasound and pathologic images of one HCC lesion with MVI

1.4 MVI诊断金标准

采用开放式或腹腔镜手术方式切除肝脏癌灶，大体观察癌灶后，每隔10 mm切片，癌周非癌肝组织每5 mm切片至包膜外30 mm，于肿瘤坏死区、非坏死区、包膜区内及包膜区外非癌肝组织多点取材，然后石蜡包埋，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜观察。由2名具有10年以上肝脏病理工作资历的病理科医师在不知晓患者临床、实验室、影像学检查等信息情况下共同完成MVI诊断。本研究用于诊断MVI的指标包括 CEUS指标（AP、PVP）和 IHC指标（HSP70、GPC3），其中CEUS时AP癌旁呈高灌注诊断为MVI（+），AP癌旁呈等灌注诊断为MVI（-）；PVP癌旁呈低灌注诊断为MVI（+），PVP癌旁呈等灌注诊断为MVI（-）；HSP70阳性、GPC3阳性均诊断为MVI（+），阴性均诊断为MVI（-）。上述数个诊断指标联合诊断如满足“AP高灌注”、“PVP低灌注”两个条件中至少一个即诊断为MVI（+），“AP等灌注”且“PVP等灌注”诊断为MVI（-），“PVP低灌注”并且“IHC指标双阳性”时诊断为MVI（+），“PVP等灌注”和/或“IHC中至少有一个阴性”诊断为MVI（-）。

1.5 统计学方法

采用STATA 15.0和SPSS 26.0统计学软件进行统计分析。用卡方检验或Fisher确切概率法比较计数资料在MVI（+）组和MVI（-）组的组间差异。符合正态分布和方差齐性的计量资料用均数±标准差表示，用独立样本t检验比较其在MVI（+）组和MVI（-）组的组间差异。分别计算CEUS指标（AP、PVP）和IHC指标（HSP70、GPC3）单独及联合诊断MVI的敏感度、特异度、准确率、约登指数、受试者工作特征（receiver operator characteristic curve，ROC）曲线的下面积（area under curve，AUC）。采用Delong检验比较各个指标间AUC的差异。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料比较

MVI（+）组（n=23）和MVI（-）组（n=119）患者在年龄、性别、肝炎病史、Child-Pugh分级、病灶位置等分布差异均无统计学意义（均P＞0.05），但MVI（+）组的病灶最大直径大于MVI（-）组（P＜0.001）。两组患者的基线资料比较见表1。

表1 MVI（+）组和MVI（-）组患者的基线资料比较Tab.1 Comparison of baseline characteristics between MVI(+)group and MVI(-)group

2.2 MVI的诊断效率

ROC曲线分析显示，CEUS指标（AP、PVP）和IHC指标（HSP70、GPC3）单独诊断MVI时，PVP的诊断效率最高，准确率和AUC分别达91.0%和0.893。AP+PVP联合诊断（满足AP癌旁高灌注和/或PVP癌旁低灌注）的敏感度、特异度、准确率分别为91.9%、92.1%、92.1%，提高了AP、PVP单独诊断时的效率。HSP70和GPC3无论单独诊断还是联合应用的诊断效率均低于AP+PVP联合诊断。仅就IHC指标来看，GPC3+HSP70联合诊断的效能（准确率为79.8%，AUC为0.790）优于单独GPC3（准确率为69.5%，AUC为0.752）或单独HSP70（准确率为60.7%，AUC为0.701）诊断。与GPC3+HSP70联合诊断（敏感度为77.8%）相比，PVP+GPC3+HSP70联合诊断的敏感度（69.4%）降低，但特异度提高至98.5%，准确率为92.5%。其中AP+PVP联合、PVP单独和PVP+GPC3+HSP70联合诊断的AUC分别为0.918、0.893、0.840，其中AP+PVP联合诊断的AUC优于PVP+GPC3+HSP70联合诊断组合（P=0.033）。见表2。

表2 CEUS和IHC指标对HCC的MVI的诊断效率Tab.2 Diagnostic efficacy of CEUS and IHC indicators on MVI of HCC

由于病灶大小在MVI（+）和MVI（-）组间存在差异，因此以ROC曲线的最大约登指数（敏感度+特异度-1）对应的病灶直径17.5 mm为界值分为≤17.5 mm组（n=93）和＞17.5 mm组（n=80）两个亚组。鉴于分亚组前PVP+GPC3+HSP70联合诊断准确率最高，因此进一步采用该组合进行亚组分析，结果显示，在两个亚组中，PVP+GPC3+HSP70联合诊断均可以实现对MVI阳性和阴性病灶的良好区分（P＜0.001）。尤其在病灶直径＞17.5 mm亚组中，PVP+GPC3+HSP70联合诊断具有较好的效能，准确率为98.8%，AUC为0.993，敏感度为100.0%。见表3。

表3 在不同病灶大小亚组中PVP+GPC3+HSP70联合诊断MVI的效能Tab.3 Diagnostic efficiency of PVP+GPC3+HSP70 for MVI in different lesion size subgroups

3 讨论

本研究表明，CEUS癌旁的AP和PVP异常灌注对诊断MVI均有积极的作用。众所周知，病灶内的AP高灌注和PVP低灌注是组织学上中晚期HCC的典型表现，该特征体现病灶内发生了显著的血流动力学改变。随着HCC的进展，病灶内非配对小动脉数量增加，导致AP血流量增加；同时动静脉瘘形成导致肝静脉压力增加并反向［18-19］。因此，AP造影剂快速进入，而PVP造影剂快速洗脱；图像上则表现为AP高灌注及PVP低灌注。癌旁发生MVI时，也会出现类似HCC的表现。癌旁的MVI区域正常的微血管密度降低，新形成大量存在结构和功能异常（不成熟、易渗漏）的微血管，从而形成动静脉瘘和静脉癌栓。这会导致发生MVI处的造影剂快速进入，并加快洗脱［20］。本研究中MVI（+）组的HCC出现AP高灌注的比例（54.1%，20/37）明显高于MVI（-）组（28.6%，40/140），MVI（+）组出现PVP低灌注的比例高达91.9%（34/37），与上述研究AP和PVP表现类似。

本研究还发现，与AP比较，示卓安®造影剂特有的PVP对MVI有更强的诊断能力。PVP指标在癌旁低灌注诊断模式时对HCC的MVI的诊断准确率达到91.0%，AUC值为0.893，均明显高于AP。从CEUS的成像机制角度考虑，PVP比AP诊断效率更高的研究结果提示MVI的发生可能与肝脏枯否细胞损耗有关。超声造影剂进入肝脏后，约99%的造影剂微泡会被肝血管窦中的枯否细胞吞噬（但不破坏），这会延缓造影剂进入肺循环而被清除。因此，示卓安®造影剂可以表现出超长时间的PVP成像，即“枯否成像”［21］。本研究中，未发生MVI的病灶周边绝大多数（92.1%，129/140）在PVP表现为与周边肝实质一致的等灌注，而发生MVI的病灶绝大多数（86.5%，32/37）在PVP表现为类似癌灶的低灌注。这可能是因为癌细胞侵犯的区域破坏了肝血管窦，肝窦内枯否细胞数量减少，甚至消失［22］；因此被枯否细胞吞噬的造影剂减少，所以造影剂快速进入肺循环廓清。有研究证实肝癌分化程度越低，HCC癌灶内枯否细胞的计数越少［23］，MVI发生率越高［24］，这也间接证实了MVI与PVP癌旁低灌注之间的相关性。

HCC的肿瘤异质性较强。研究发现，表达一些特殊分子标志物的HCC更容易发生MVI。GPC3作为肝癌的特异性标志物之一［25］，表达水平与MVI发生率相关［15］。热休克蛋白家族成员HSP70的血浆蛋白水平也与MVI相关［26］。本研究对穿刺标本进行GPC3和HSP70检测，以观察其对MVI的诊断效能。虽然GPC3和HSP70联合诊断的敏感度稍降低（单独GPC3和HSP70诊断及两者联合诊的敏感度分别为86.5%、86.1%和77.8%），但联合诊断的特异度大幅度提高，从单独GPC3和HSP70诊断的特异度65.0%和54.0%，提升至80.3%。在此基础上，本研究进一步联合使用GPC3、HSP70和PVP以期提高MVI诊断效能，结果显示，PVP+GPC3+HSP70联合诊断的特异度提高至98.5%，准确率为92.5%。既往研究已报道，病灶大小是MVI的独立风险因素［27］。本研究在亚组分析中排除病灶大小的影响后，结果依然显示PVP+GPC3+HSP70联合诊断获得较好的诊断效率，尤其在病灶直径＞17.5 mm中，该组合表现出较高的诊断价值，准确率为98.8%，AUC为0.993，敏感度为100.0%。考虑到MVI阳性诊断可对HCC患者治疗策略的选择产生较大影响（如需要增加术前新辅助治疗以及术中需要获得更宽的切缘等），因此为了避免过度治疗，选择特异度更高的指标对降低假阳性率具有更好的临床意义。因此，认为最适宜的MVI诊断标准是GPC3/HSP70双阳性联合CEUS癌旁PVP低灌注特征。

本研究也存在以下局限性：⑴本研究为小样本回顾性研究，纳入的MVI阳性病例数有限，因此CEUS和IHC标志物诊断MVI的价值仍需验证集或前瞻性研究进一步评估。但是，本研究只收集了最大直径不超过3 cm的HCC。由于肝脏环境的复杂性，特别是肝硬化背景下，小肝癌一直是术前影像学诊断的难点［28］。目前专门以小HCC为目标病灶的MVI研究较少。因此，基于小肝癌的MVI研究尤其必要。⑵GPC3和HSP70对MVI的诊断效率不高。考虑可能是因为本研究采用的诊断原则为有、无染色的简单分类，未依据染色程度划分等级。因此，仍需进一步对IHC标志物进行详细分类，观察能否提高MVI的诊断效率。⑶GPC3和HSP70诊断MVI尚属于初步探索，虽然取得了阳性结果，但其潜在机制还有待进一步挖掘。

综上所述，采用IHC标志物（GPC3和HSP70）和CEUS（AP和PVP）进行HCC（尤其是小HCC）手术前的MVI诊断是可行的方法，其中PVP+GPC3+HSP70的联合应用是术前诊断MVI较为理想的方案，未来值得开展大样本、多中心、前瞻性研究进一步证实。