新生儿黄疸G6PD基因突变及实验室相关指标分析

王杨 吉永 匡野 付晓野 杨晓青 李祎

新生儿黄疸（neonatal jaundice）在新生儿中十分常见。有文献研究表明，其发病率达0.35%～0.57%以上［1］，见于80%以上早产儿和60%以上足月儿，占住院新生儿的20%～40%［2］。由于新生儿早期胆红素的代谢特点、疾病因素，新生儿黄疸可以是预后良好的暂时生理现象，也可以是预后较差的疾病表现。

如果未及时发现和治疗血清中升高的胆红素，可能在下列几个方面影响到新生儿的远期临床预后：一、黄疸可能发导致智力发育低下、痴呆以及大脑发育障碍；持续的黄疸还可能使患儿发生胆红素脑病或核黄疸，给患儿大脑造成不可逆的神经系统损害。二、一些严重的黄疸，如溶血性黄疸还会损伤肝肾功能，使患儿多器官衰竭［3］。因此研究能够有效辅助临床早期诊断和治疗新生儿黄疸的实验室相关指标显得尤为重要。而遗传因素对新生儿黄疸的发生起着十分重要的作用，G6PD基因突变即是其中一种。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年8月至2019年3月昆明市延安医院新生儿黄疸患儿134 例，男性91 例，女性43 例，日龄2 h 至28 天。其中91 例患儿为病理性黄疸，占67.91%，43 例患儿为生理性黄疸，占32.09%。纳入标准：符合《儿科学》［4］中的诊断标准：①出生后24 h 内即出现黄疸，持续时间长，足月儿＞2 周，早产儿＞4 周仍不退；②血清总胆红素足月儿超过220 μmol/L，早产儿超过257 μmol/L；③每日血清胆红素升高超过5 mg/dL 或每小时＞0.5 mg/dL；④结合胆红素超过34 μmol/L。排除标准为入院时合并以下疾病或情况的患儿：早产、过期产、溶血病、感染、颅内出血及巨大头颅血肿、新生儿出血症、先天畸形（消化道畸形、先天性心脏病）、甲状腺功能低下、唐氏综合征、红细胞增多症、出生窒息、缺氧缺血性脑病、肝功能异常及直接胆红素升高。从134 例患儿中留取2018年11月至2019年3月的新生儿黄疸患儿49 例作为G6PD基因突变检测对象，男性33 例，女性16 例，其中37 例患儿为病理性黄疸，占75.51%，12 例患儿为生理性黄疸，占24.49%。日龄2 h 至20 d。本研究通过院伦理委员会批准，并获得患儿法定监护人的知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 样品采集对49 名新生儿黄疸患儿进行静脉采血1.0～2.0 mL，EDTA 抗凝，-20℃保存。

1.2.2 基因提取

采用吸附柱法，首先利用裂解液促使细胞破碎，使细胞内核酸释放出来；然后将释放的核酸特异性地吸附在特定的硅胶膜上；然后将吸附在硅胶膜上的核酸用洗脱液洗脱下来，得到纯化的核酸。用超微量分光光度计NP80Touch 测定提取的DNA 样本的浓度和纯度，DNA 样本的OD260nm/OD280nm 应在1.6～2.0 范围之间，且OD260nm/OD230nm≥2.0。

1.2.3G6PD基因突变检测

使用上海宏石医疗科技有限公司生产的荧光定量PCR 仪（型号：SLAN-96S），应用厦门致善生物科技股份有限公司生产的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测试剂盒（荧光PCR 熔解曲线法，批号：17121501、18120601）进行G6PD基因突变，具体方法如下：PCR 扩增反应体系设为25 μL，PCR反应程序为：50℃2 min-95℃10 min→（95℃15 s →65℃～56℃（每个循环下降1℃）15 s →76℃20 s）×10 个循环→（95℃15 s →55℃15 s →76℃20 s）×50 个循环。使用实时荧光PCR 仪，共有FAM、HEX、ROX 和Cy5 四个通道，设置在55℃退火阶段时采集荧光信号。熔解曲线分析程序设置如下：95℃1 min →35℃3 min →40℃～85℃以0.4℃/5 s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集FAM、HEX、ROX 和Cy5 通道荧光信号。将待测样本八个检测通道（A、B 体系中）的熔解峰与野生型对照对应通道的熔解峰之间熔点（Tm 值）的差异进行比较，从而判断核酸样本是否发生G6PD基因突变。与野生型对照对应熔解峰比较差异（ΔTm 值）在±1℃以内的样本熔解峰为野生型峰，差异超过±2℃即为突变型峰。

1.2.4 胆红素测定

使用美国贝克曼库尔特有限公司生产的全自动生化分析仪（型号：AU5421），采用北京九强生物技术股份有限公司生产的总胆红素测定试剂盒（钒酸盐氧化法，批号：17-0603、18-0605）和直接胆红素测定试剂盒（钒酸盐氧化法，批号：17-0615、18-0612），血清胆红素在PH3.0 的条件下，会与钒酸反应，生成胆绿素，通过检测胆红素氧化前后的吸光度变化，可以计算出样品血清中胆红素浓度水平。

1.2.5 葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性检测

采用比值法，在吩嗪二甲酯硫酸盐递氢的促进下，NADPH 的H 传递给氧化型NBT（硝基四氮唑蓝）（黄色），使之转变为还原型NBT（蓝色），蓝色的深浅与NADPH 生成量一致（S1）；同法测定6PG 生成的NADPH 的量（S2），通过S1/S2 判断NADPH 生成的相对含量，从而判断G6PD是否缺乏。

1.2.6 统计学方法

采用SPSS 软件进行分析；计数资料以（%）表示；计量资料以（）表示，各组间比较采用两独立样本t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 G6PD 基因突变检测结果

49 例新生儿黄疸患儿之中，共检出3 例G6PD基因突变，发生率为6.12%，其中c.1376G＞T纯合突变2 例（66.67%），c.95A＞G 纯合突变1 例（33.33%）。基因突变患儿均为男婴。G6PD基因突变率为6.12%。其余未检出突变。3 例突变病例均为病理性黄疸，G6PD酶活性均有大幅降低，数值为0.62±0.24（U/gHb），病理性黄疸突变率为8.10%。

2.2 生理性黄疸和病理性黄疸之间各实验指标差异

生理性黄疸组与病理性黄疸组之间总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、血红蛋白、红细胞压积、网织红细胞绝对值比较，差异有统计学意义（t=-14.15、-3.55、-14.12、-3.93、-3.62、2.79，P＜0.05）；两组超敏CRP、红细胞数比较，差异无统计学意义（t=-0.47、-2.73，P＞0.05）。见表1。

表1 生理性与病理性黄疸之间实验室相关指标比较（±s）Table 1 Comparison of related laboratory indicators between physiological and pathological jaundice（±s）

表1 生理性与病理性黄疸之间实验室相关指标比较（±s）Table 1 Comparison of related laboratory indicators between physiological and pathological jaundice（±s）

分组生理性黄疸组病理性黄疸组t 值P 值n 43 91总胆红素（μmol/L）153.97±49.80 283.69±49.00-14.15＜0.05直接胆红素（μmol/L）16.67±8.71 23.85±14.60-3.55＜0.05间接胆红素（μmol/L）137.29±46.63 259.84±47.44-14.12＜0.05超敏CRP（mg/L）2.19±3.11 2.68±4.48-0.47＞0.05血红蛋白（g/L）142.28±20.09 156.61±18.91-3.93＜0.05红细胞（×1012）4.15±0.63 4.44±0.58-2.73＞0.05红细胞压积（L/L）0.41±0.06 0.45±0.05-3.62＜0.05网织红细胞绝对值（×1012）0.18±0.09 0.12±0.07 2.79＜0.05

3 讨论

本研究结果与文献结果［5］一致，表明了直接胆红素、间接胆红素、血红蛋白、红细胞压积等实验室相关指标作为辅助判断生理性黄疸和病理性黄疸的有效指标有一定价值。当数值较高时，就可提前预测病理性黄疸，及时进行预防。Newman［6］等也曾提出网织红细胞可用于诊断新生儿黄疸。

遗传因素是引起新生儿黄疸的重要原因之一，有研究表明G6PD基因突变、GST基因多态性、UGT1A1基因多态性［7］等遗传因素与新生儿黄疸有明确的相关性。我国G6PD基因缺陷及其引起的G6PD缺乏症［8］导致新生儿黄疸临床多见。2004年美国儿科学会在《新生儿高胆红素血症诊疗方案》中将G6PD缺乏作为≥35 周新生儿黄疸的高危因素［9］。

至今，世界范围内已发现的140 多种G6PD基因突变型［10］，呈高度异质性，除第3 和第13 外显子外，整个基因皆可发生突变，且在所发现的基因突变型中，85.4%表现为单个碱基置换的错义突变，另有8.0%为复合突变［11］。但半数突变并不影响酶的活性，不引发溶血。G6PD基因突变在不同的地域以及不同的民族之间有着较高的异质性，我国G6PD基因突变的分布情况呈现“南高北低”势态［12］，其中尤以云南、四川、贵州、广东、广西等地为高发区。中国人群中以G1388A、G1376T、C1024T、C1044T、G871A 和A95G6 种点突变多见；非洲人中常见G202A、A376G 和G680T 等点突变；地中海人群中，最常见的突变是C563T。本次研究定性检测人外周血基因组DNA 中中国人群常见的12 种G6PD基因突变：c.95A＞G、c.383T＞C、

c.392G＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A。本研究还对49 例新生儿黄疸进行了G6PD基因突变检测，共检出3 例G6PD基因突变，其中c.1376G＞T 突变是主要的G6PD突变型之一，它也是中国人群中最常见的点突变类型之一，此与湖南长沙地区［13］、广西百色地区［14］、柳州地区［15］、潮州市［16］、海口地区［17］等地的主要G6PD基因突变型一致。

G6PD基因位于X 染色体长臂2 区8 带（Xq28），长约18 kb，其中含有12 个内含子和13 个外显子，可编码515 个氨基酸，正常野生型为G-6-PDB。G-6-PD 缺乏症系由其基因变异所致，是一种伴X染色体不完全显性遗传病［18］，女性纯合突变及男性突变均会引起严重临床表现，呈重度缺陷。而女性杂合突变临床表现可正常，但也可能将缺陷基因遗传给下一代，表现正常的女性杂合突变要用基因检测进行诊断［19］。目前认为G6PD基因突变主要为单个碱基置换导致的错义突变改变编码蛋白质，从而使蛋白质的生物功能出现差异。这种改变的完成通常包括两个机制：改变G6PD功能结构区的功能和影响G6PD二聚体的形成。G6PD功能结构区包括NADP+（氧化型辅酶Ⅱ）和G6P（葡萄糖-6-磷酸）结合区。突变位于氨基酸则引起的临床症状较轻，而突变位于羧基端则引起的临床表现较重，尤其是位于NADP+结合区或G6P 结合区时临床表现最为严重。当c.1376G＞T 突变或c.1388G＞A 突变时，置换位置出现在NADP+结合区的附近，可能影响NADP+结合区和G6P 结合区的功能，故常出现较为严重的新生儿黄疸及溶血。

G-6-PD 参与的磷酸己糖旁路代谢途径，是唯一能产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）的来源。NADPH 是一种重要的还原物质，存在于红细胞中，可将氧化型谷胱甘肽经还原反应转变为还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH），而GSH 可以使巯基的蛋白质、酶受到保护，免受氧化剂（尤其是过氧化物）的损害，保护红细胞膜的完整性。由于G-6-PD 基因变异所致的酶活性下降，会导致GSH 不足，当机体接触氧化物质（如某些药物）后，血红蛋白氧化变性，细胞膜被损伤，发生溶血，导致患者出现黄疸。

目前针对G6PD基因突变患者的治疗无根治疗法，以疾病发作时对症治疗为主，严重者治疗效果不佳，在基因水平上修复这些突变位点将改善这一现状。目前，已经有学者成功构建了HEK293T稳定细胞株，这是一种能够敲除G6PD基因c.392G＞T 突变位点的细胞株，该研究成果为后期研究其基因修复奠定了基础［20］。有研究证明［21］，花生四烯酸能够抑制磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）通路，同时还能抑制G6PD突变基因的表达，其机制是通过p38 丝裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK），磷酸化胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的307 位丝氨酸。还有学者构建动物实验研究发现可以通过多不饱和脂肪酸激活剪接沉默子而减少G6PD 基因前体mRNA的表达。

综上所述，G6PD 基因突变与新生儿黄疸有着密切的相关性。随着对G6PD 基因突变与新生儿黄疸的关系的深入研究，可以对新生儿黄疸患者进行基因检测，判断G6PD 基因突变型与新生儿胆红素浓度关系，从而进行黄疸动物模型建立考察药物或基因编辑等手段对黄疸的消退作用，预测新生儿黄疸的可能性并及时对症处理。