地贫核酸检测国家参考品对单分子测序试剂的适用性评价

于婷 胡泽斌 黄杰 孙楠

地中海贫血（以下简称地贫）是指因珠蛋白基因缺陷（包括点突变、缺失等）导致的一种常染色体隐性遗传病［1-3］，重者以进行性溶血性贫血为主要特征。我国以两广地区、海南等南部沿海地区发病率最高［4］。重型地贫目前尚无经济有效的治疗方法，因此通过遗传咨询与产前筛查技术是避免重型胎儿出生的最佳措施。截止到2022年7月，已有20 多个地中海贫血基因检测试剂盒获得医疗器械注册证，检测原理包括跨越断裂点PCR（Gap-PCR）等。由于检测原理及平台不同，存在漏检、假阴性及交叉反应等风险点，中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）在2017年发布了地中海贫血核酸检测国家参考品（以下简称国家参考品），作为统一尺度评价各类试剂盒的性能。随着测序技术的发展，第三代测序技术（即单分子测序）也开始应用在地中海贫血基因突变检测上，部分已开发成试剂盒。由于国家参考品研制时，只采用了当时已上市试剂盒进行验证，并不包含三代测序技术的试剂盒，因此本研究拟开展该套参考品适用范围的扩展研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象

地中海贫血核酸检测国家参考品，批号：360014-201701，32 支/套，包含α 缺失和突变、β 缺失和点突变以及正常人样本，由中检院研制并提供。

1.2 试剂

地中海贫血基因检测试剂盒（单分子测序法）、核酸提取或纯化试剂、测序反应通用试剂盒（杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司）；Qubit dsDNA HS Assay Kit（美国ThermoFisher SCIENTIFIC 公司）；No-Amp Accessory Kit、Sequel II Binding Kit 2.1、SMRT Cell 8M（1-Cell Tray）、Sequel II Sequencing Plate 2.0（1 rxn）（美国Pacific Biosciences 公司）。

1.3 仪器和软件

Sequel II CNDx 基因测序仪、地中海贫血基因检测数据分析系统（杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司）；Qubit 荧光定量仪Qubit3.0（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；基因扩增仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 地中海贫血基因检测试剂盒（单分子测序法）试剂盒检测原理

基于第三代测序技术平台的单分子实时DNA测序技术（Single Molecule Real-Time，SMRT）。针对人全血样本，通过在各突变位点附近设计引物，直接对目标区域进行长片段扩增，在目标DNA 长片段两端连接接头，使用消化酶去除非环状片段，最终获得哑铃状文库。试剂盒配套使用基因测序仪Sequel II CNDx，构建好的哑铃状文库结合测序引物和酶，在SMRTCell 的纳米小孔（ZMW）中进行单分子测序。测序后的基因序列对比到参考基因序列上，通过生物信息软件分析，识别携带基因突变的DNA 序列，获得相关基因突变信息。具体过程见图1。

图1 地中海贫血基因检测试剂盒（单分子测序法）试剂盒检测原理Figure 1 The detection principle of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing）kit

1.4.2 适用性研究方案

按照α/β-地中海贫血基因分型检测试剂盒行业标准（YY/T 1527-2017）［5］及国家参考品说明书要求，确定研究项目为准确性、特异性及检测限。要求检测试剂盒范围内的国家阳性参考品，结果应为相应基因型别；检测国家阴性参考品和试剂盒范围外的国家阳性参考品，结果应为未检出突变；检测限浓度要求不高于10 ng/μL，本研究中采用试剂盒声称的检测限浓度（3 ng/μL）进行考察。

1.4.3 文库构建、纯化及质检

取国家参考品恢复至室温混匀备用，并将试剂盒检测范围内的国家参考品稀释至3 ng/μL 混匀备用，即为检测限参考品。按照试剂盒说明书的操作方法，对国家参考品扩增、接头连接、消化反应构建DNA 文库；完成后，立即使用配套的DNA 纯化试剂盒进行两次纯化，并对纯化后到的文库进行质检。采用Qubit 荧光定量仪检测，满足以下条件方可进行上机测序：①单个文库浓度≥3 ng/μL；NTC 文库浓度≤1 ng/μL；②等质量混合后文库浓度≥3 ng/μL。

1.4.4 上机测序

采用测序反应通用试剂盒，按照说明书要求对质检合格的文库处理后上机。文库上机浓度180～220 pM，推荐200 pM，文库片段默认2 535 bp。按照配套仪器Sequel II CNDx 基因测序仪的标准操作规程上样，测序模式选择CCS，测序时长15 h。

1.4.5 数据分析和结果判定

采用地中海贫血基因检测数据分析系统对下机数据进行分析，结果判定原则为：对于α 缺失型阳性判断值以5%为阈值，根据--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI及WT（野生型或非缺失）的比值结果，判定为缺失型杂合突变、双杂合突变、纯和突变或者野生型；对于α 和β 点突变阳性判断值，以突变比值≥20%且≤80%，判定为对应杂合点突变；突变比值＞80%，判定为对应纯合点突变；突变比值＜20%时，判定为N，表示未检出检测范围内的突变。

2 结果

2.1 准确性结果

检测范围内的国家阳性参考品的检测结果均为相应突变型别，准确性满足要求。见表1。

表1 地中海贫血基因检测试剂盒（单分子测序法）的准确性结果Table 1 Accuracy results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

2.2 特异性结果

野生型国家参考品及检测范围外的国家阳性参考品的缺失检测结果均显示为αα/αα，点突变检测结果均显示为“N”，特异性满足要求。见表2。

表2 地中海贫血基因检测试剂盒（单分子测序法）的特异性结果Table 2 Specific results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

2.3 检测限结果

稀释至3 ng/μL 的试剂盒检测范围内的国家阳性参考品检测结果均符合预期，检测限满足要求。见表3。

表3 地中海贫血基因检测试剂盒（单分子测序法）的检测限结果Table 3 Detection limit results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

3 讨论

地贫以α 和β 型最为常见［6-7］。缺失型α 地贫95%以上是由于α 珠蛋白基因大片段缺失所致。我国最常见的是--SEA、-α3.7 和-α4.2 缺失型突变。最常见的非缺失型α 地贫包括αWS（CD122）、αQS（CD125）等［8-9］。我国β 地贫以突变型为主，主要有IVS-Ⅱ-654、CD41/42 等［10-11］。基因检测在地贫的防控中不可或缺。目前检测方法主要有Gap-PCR 法、PCR-反向斑点杂交法、二代测序法等［12］。Gap-PCR 法主要用于缺失型α 地贫诊断［13］，该方法设备要求低、步骤简单，但不能诊断点突变或未知的缺失突变。PCR-反向斑点杂交法主要用于点突变检测，可对未知样本中多个突变进行筛查，但检测时间长、操作复杂、影响因素较多。二代测序技术具有高通量等优点，对于单核苷酸多态性和小于50 bp 的插入或缺失变异检测比较准确，但是大的结构变异检测却不是很理想。近几年推出的单分子测序技术［14-15］，优势在于DNA 无需PCR 扩增，可避免在扩增过程中引入DNA 突变以及对富含AT 和富含GC 序列的偏好性，实现对每一条DNA 的单独测序。它可产生超长的读长结果，具有高度均一性，可获得许多当前测序平台无法得到的基因组信息。因此采用单分子测序技术有利于提高地中海贫血产前筛查的准确性。

为评价基于不同检测原理的地中海贫血核酸检测试剂盒的性能，中检院建立了国家参考品，包含7 种α-突变以及18 种β-突变。本研究中，采用国家参考品对基于PacBio 单分子测序的地中海贫血基因检测试剂盒进行评价。结果显示：无α 缺失的样本，--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI比值在0～0.88%范围内，远低于阈值（5%），而野生型样本的WT 比值均在99%以上。α 缺失的样本，--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAI中一种或者两种的比值在42.19%～99.83%范围内，远高于阈值（5%）；α 或β 点杂合突变样本，突变比值均在20%～80%范围内，α 或β 点纯合突变样本，突变比值均＞80%，无α 或β 点杂合突变样本，突变比值均显示为＜20%。准确性和特异性均符合预期结果，阈值设置合理。当把试剂盒检测范围内的阳性参考品稀释至检测限浓度（3 ng/μL）后进行检测，结果亦满足要求。要指出的是，5 例检测范围外的国家阳性参考品，2 例为未设计相应位点探针，故无检测数据输出，另外3 例虽设计了位点亦可检出，但考虑到后期临床样本较难获得，申报医疗器械注册证难以获批，因此在结果设置上显示为野生型，这也是在现有法规体系下的一种折衷做法。以上结果表明，基于单分子测序平台的待评价试剂盒，国家参考品检测结果未出现假阳性或假阴性情况。综上所述，地中海贫血核酸检测国家参考品，适用于三代测序的地中海贫血检测试剂盒质量评价要求，有利于促进同类试剂盒的标准化工作。