人巨细胞病毒感染和血清TNF-α、IL-1、IL-6水平与自然流产相关性的Meta分析

叶 雄，赵明丽，张 玲，于欢欢，夏雪山，董书维

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650093)

0 引 言

人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)属于疱疹病毒β亚科，人群普遍易感，其全球血清阳性率约为83%[1].HCMV感染会增加孕妇不良妊娠结局发生几率，导致育龄女性母体流产、胎儿先天畸形、新生儿窒息和低出生体重等[2].在不良妊娠结局中，自然流产占15%～40%，给孕妇及其家庭造成严重伤害[3-4].然而现有研究对HCMV感染引起自然流产等不良妊娠结局的机理机制了解有限[5].肿瘤坏死因子-α(Tumour Necrosis Factor,TNF-α)、白细胞介素-1(Interleukin 1,IL-1)和白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)等细胞因子表达水平与自然流产的发生密切相关.王力等[6]和李雪莲等[7]研究认为自然流产与血清TNF-α、IL-1或IL-6水平下调有关，也有研究[8-9]显示自然流产与TNF-α、IL-1或IL-6水平上调有关.TNF-α、IL-1和IL-6的表达受多种因素调控，如HCMV感染会导致血清TNF-α、IL-1和IL-6的表达水平升高[10-11].HCMV感染引起细胞因子表达水平改变是否与自然流产发生相关尚不清楚.

本文旨在通过对HCMV感染与自然流产及细胞因子相关性分析，探究HCMV感染导致自然流产与TNF-α、IL-1和IL-6细胞因子的相关性，为育龄妇女优生优育临床实践提供理论参考.

1 资料与方法

1.1 文献检索策略

检索CNKI、VIP、WanFang、PubMed、Web of Science和Cochrane数据库，收集从建库至2022年4月10日公开发表的相关文献.中文检索词：流产、自然流产、复发性自然流产、人巨细胞病毒、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6.英文检索词：Spontaneous abortion、SA、SAP、Recurrent pregnancy loss、RPL、Human cytomegalovirus、HCMV、TORCH、TNF-α、IL-1、IL-6.

1.2 文献的纳入及排除标准

纳入标准：1)研究对象为自然流产患者，且有正常妊娠孕妇或人工流产者作为对照，进行了HCMV核酸检测或者特异性抗体检测；2)研究对象为自然流产患者，且有正常妊娠孕妇或人工流产者作为对照，对TNF-α、IL-1或IL-6等细胞因子表达水平进行了定量检测；3)研究对象为HCMV阳性(核酸或特异性抗体检测阳性)的自然流产患者，且有HCMV阴性的自然流产患者作为对照，对TNF-α、IL-1和IL-6等细胞因子表达水平进行了定量检测.

排除标准：1)研究为综述和摘要；2)重复报道的文献；3)未明确检验方法的文献；4)缺少对照组的文献；5)数据缺失的文献.

1.3 文献资料提取与质量评价

文献资料筛选流程为：1)2位研究人员独立检索数据库，收集所有相关的文献；2)通过阅读题目和摘要完成文献初步筛选；3)阅读初筛文献全文，根据纳入和排除标准做进一步筛选；4)整合2位研究人员筛选的文献，遇有分歧时与第三位作者协商解决.

对于纳入的文献，提取以下信息：1)基本信息：第一作者、发表时间、样本量、研究类型；2)人群的分组情况；3)结局指标：HCMV阳性人数、TNF-α、IL-1和IL-6具体浓度及标准差.

采用纽卡斯尔-渥太华量表(Newcastle-Ottawa Scale,NOS)对文献进行质量评价[12]，NOS评分≥6时，为高质量文献.

1.4 统计学分析

提取所有纳入文献数据，使用Revman 5.4软件进行统计分析.计数资料采用比值比(Odds Ratio,OR)及95%置信区间(Confidence Interval,CI)作为效应量，计量资料采用标准化均数差(Standard Mean Difference,SMD)及95% CI作为效应量.对各组异质性进行检验，若异质性较小(I2<50%)，则选择固定效应模型分析，反之，选择随机效应模型进行分析.若纳入研究数量较多(5篇及以上)，则使用漏斗图判断是否存在发表偏倚，否则不予进行发表偏倚分析[13].

2 结果

2.1 文献检索结果和基本特征

使用关键词检索各个数据库，按文献检索策略检索共获得 1 214 篇文献，按照纳入及排除标准严格筛选后最终获得48篇文献[6-11,14-55](见图1).纳入的48篇文献均为病例对照研究，其中35篇[8,11,12,14-45]对自然流产与HCMV感染的关系进行了研究；16篇[6-11,46-55]对自然流产与血清TNF-α、IL-1或IL-6水平的关系进行了研究；5篇[8,10,11,18,55]对自然流产患者HCMV感染情况与血清TNF-α、IL-1或IL-6水平的关系进行了研究.

图1 文献筛选流程图Fig.1 Flow chart of literature screening

2.2 自然流产患者比正常妊娠孕妇具有更高的HCMV阳性率

在35篇[8,11,12,14-45]探究自然流产与HCMV感染关系研究的文献中，4篇文献[8,11,22,23]采用了两种方法对HCMV进行检测(ELISA检测IgM和PCR检测DNA)，直接对这4篇文献进行亚组分析，以确保对样本不重复分析.剩余31篇文献[10,14-21,24-45]只采用单一方法检测作为HCMV阳性判断依据，自然流产患者HCMV阳性率为21.33%(889/4 167)，正常妊娠孕妇HCMV阳性率为4.54%(222/4 908)，I2=74%，异质性较大，采用随机效应模型分析，结果显示自然流产患者比正常妊娠孕妇具有更高的HCMV阳性率(OR6.97,95%CI4.66～10.42,P<0.000 01)(见图2).采用漏斗图判断发表偏倚，漏斗图是一个对称的倒三角，提示纳入文献无明显发表偏倚(见图3).

图2 自然流产患者与正常妊娠HCMV阳性率比较的森林图Fig.2 Forest plot of HCMV positive rate between patients with spontaneous abortion and normal pregnancy

图3 发表偏倚Fig.3 Publication bias

将35篇文献按检测方法进行亚组分析(见表1)，其中ELISA组自然流产患者HCMV阳性率为23.27%(777/3 339)，PCR组自然流产患者HCMV阳性率为17.43%(264/1 515)，ELISA组自然流产患者HCMV阳性率显著高于PCR组(X2=21.13,P<0.001).ELISA组I2=46%，异质性较小，采用固定效应模型分析；PCR组I2=51%，异质性较大，采用随机效应模型分析.Meta分析结果显示，不论是ELISA检测(OR9.23,95%CI7.44～11.45,P=0.007)还是PCR检测(OR3.69,95%CI2.32～5.86,P<0.000 01)，自然流产患者均比正常妊娠孕妇具有更高的HCMV阳性率.

表1 亚组分析

在使用PCR检测方法的文献[8,10,11,14-25]中，检测的组织包括母体组织(外周血、胎盘样本、宫颈分泌物和阴道脱落物)和胚胎组织(胚胎组织、羊水和绒毛组织).按组织种类进行亚组分析(见表1)，母体组织组自然流产患者HCMV阳性率为18.39%(201/1 093)，胚胎组织组自然流产患者HCMV阳性率为14.93%(63/422)，两亚组自然流产患者HCMV阳性率无显著差异(X2=2.53，P>0.05).两组I2均小于50%，异质性较小，采用固定效应模型分析.母体组织组(OR2.35,95%CI1.77～3.12,P<0.000 01)和胚胎组织组(OR5.41,95%CI2.88～10.15,P<0.000 01)均显示自然流产患者比正常妊娠孕妇具有更高的HCMV阳性率.

2.3 自然流产患者比正常妊娠孕妇具有更高的血清TNF-α和IL-1水平

纳入文献中，13篇文献[6-11,46-55]检测了自然流产患者和正常妊娠孕妇的血清TNF-α水平，共包括 1 555 例自然流产患者和 1 232 例正常妊娠孕妇；6篇文献[8,11,46,53-55]检测了自然流产患者和正常妊娠孕妇的血清IL-1水平，包括537例自然流产患者和353例正常妊娠孕妇；7篇文献[6-11,47]检测了自然流产患者和正常妊娠孕妇的血清IL-6水平，包括 1 358 例自然流产患者和 1 042 例正常妊娠孕妇.三项研究异质性均较大(I2>50%)，采用随机效应模型分析.Meta分析结果显示自然流产患者比正常妊娠孕妇有更高的血清TNF-α水平(SMD2.69,95%CI2.36～3.82,P<0.000 01)和IL-1水平(SMD4.81,95%CI2.20～7.42,P=0.000 3)，血清IL-6水平无显著差异(SMD0.37,95%CI-2.80～3.55,P=0.82)(见图4).采用漏斗图判断发表偏倚，所有漏斗图均是一个对称的倒三角，提示纳入文献无明显发表偏倚(见图5).

图4 自然流产患者与正常妊娠孕妇血清TNF-α、IL-1和IL-6表达水平比较的森林图Fig.4 Forest plot of serum TNF-α,IL-1 and IL-6 levels in patients with spontaneous abortion and normal pregnancy

(A)、(B)和(C)分别为TNF-α、IL-1和IL-6 meta分析所纳入文献的漏斗图图5 发表偏倚Fig.5 Publication bias

2.4 HCMV阳性比阴性自然流产患者具有更高的血清TNF-α、IL-1和IL-6水平

共有4篇文献[8,10,11,18]检测了HCMV阳性与阴性的自然流产患者血清TNF-α和IL-6水平，包括123例HCMV阳性自然流产患者和368例HCMV阴性自然流产患者；4篇文献[8,11,18,55]检测了HCMV阳性与阴性的自然流产患者血清IL-1水平，包括209例HCMV阳性自然流产患者和378例HCMV阴性自然流产患者.三项研究异质性均较大(I2>50%)，采用随机效应模型分析.Meta分析结果显示HCMV阳性自然流产患者比阴性自然流产患者有更高的血清TNF-α水平(SMD1.45,95%CI0.88～2.02,P=0.000 4)、IL-1水平(SMD5.11,95%CI1.86～8.36,P<0.000 01)和IL-6水平(SMD4.28,95%CI1.01～7.55,P<0.000 01)(见图6).由于所纳入文献均少于5篇，不予进行发表偏倚分析.

图6 HCMV阳性与阴性的自然流产患者血清TNF-α、IL-1和IL-6表达水平比较的森林图Fig.6 Forest plot of serum TNF-α,IL-1 and IL-6 levels in HCMV positive and negative patients with spontaneous abortion

3 讨 论

HCMV感染普遍，该病毒感染与自然流产等不良妊娠结局的发生关系密切，还是引起先天感染的主要病原体之一.然而其导致自然流产的机理机制尚不清楚.本研究对HCMV感染与自然流产的相关性进行了验证，发现自然流产患者比正常妊娠孕妇有更高的HCMV阳性率(OR6.97,95%CI4.66～10.42,P<0.000 01)，这一结果与已有研究[8,10,11,14-45]一致.HCMV感染会引发机体免疫应答，导致细胞因子等表达水平发生变化.本研究发现自然流产患者比正常妊娠孕妇具有更高的血清TNF-α水平(SMD2.69,95%CI2.36～3.82,P<0.000 01)和IL-1水平(SMD4.81,95%CI2.20～7.42,P=0.000 3)，而IL-6水平(SMD0.37,95%CI-2.80～3.55,P=0.82)在两组间无显著差异；HCMV阳性比阴性自然流产患者具有更高的血清TNF-α水平(SMD1.45,95%CI0.88～2.02,P=0.000 4)、IL-1水平(SMD5.11,95%CI1.86～8.36,P<0.000 01)和IL-6水平(SMD4.28,95%CI1.01～7.55,P<0.000 01).以上结果表明自然流产的发生与血清TNF-α和IL-1水平升高相关，而HCMV感染可引起血清TNF-α和IL-1水平上调，意味着HCMV感染可能通过上调血清TNF-α和IL-1水平，从而促使自然流产发生.

目前，临床主要通过ELISA或PCR对HCMV感染情况进行检测，检测样本可来自母体或胚胎组织.本研究证实母体组织和胚胎组织的HCMV阳性率无显著差异(X2=2.53，P>0.05)，且均显示自然流产患者比正常妊娠孕妇有更高的HCMV阳性率，与Shi等[56]研究结果一致.然而在纳入文献中，胚胎组织样本量非常有限，因此胚胎HCMV感染是否是自然流产的危险因素需要更多研究予以验证.ELISA检测具有血液标本易获取和操作简单快捷等优点，是临床HCMV检测最常用的方法.PCR检测则有更高的特异性和灵敏度，但其操作更为复杂，是临床另一种常用的检测方法[57].本研究中共有24篇文献[8,11,22,23,26-45]使用ELISA检测了HCMV IgM判断HCMV感染情况，自然流产患者HCMV阳性率为23.27%(777/3 339)；15篇[8,10,11,14-25]文献使用PCR检测了HCMV DNA判断HCMV感染情况，自然流产患者HCMV阳性率为17.43%(264/1 515)，两组的HCMV阳性率差异显著(X2=21.13,P<0.001).使用ELISA和PCR检测的自然流产患者的数量具有差异，分别为 3 339 例和 1 515 例，可能是HCMV阳性率差异的原因.同时，也不能排除ELISA检测结果假阳性的可能，标记抗原位点特异性不够、体内存在自身抗体和嗜异性抗体等原因均可造成ELISA检测结果出现假阳性.纳入文献未提供ELISA检测使用的检测试剂和PCR检测的目的基因与引物等详细信息，本研究无法判断ELISA检测出现更高HCMV阳性率的具体原因，建议后续的相关研究应提供更为详细的检测信息.此外，HCMV感染后可处于潜伏或活动性感染状态，HCMV的感染状态与自然流产的发生是否存在关系尚未可知，Shi等[56]研究指出IgM和DNA阳性并不意味着HCMV活动性感染，IgM抗体可在初次感染数年后于母体血清中检测到，而DNA不仅存在活动性感染者体内，也存在于潜伏感染者体内.mRNA阳性也可以作为HCMV活动性感染的指标，能反应当时的感染情况，与IgM和DNA阳性相比结果更加可靠[58].在本研究中，只有一项研究[11]对mRNA进行了检测，故未纳入亚组分析.总之，IgM和DNA阳性均不能作为HCMV活动感染的依据，活动性感染是否会更容易导致自然流产有待进一步研究.

细胞因子表达水平的改变被认为与自然流产的发生具有相关性.TNF-α和IL-6分别属于辅助型T细胞1(T helper 1 cell,Th2)和辅助型T细胞2(T helper 2 cell,Th2)型细胞因子，Th1以调节细胞免疫为主，通过分泌Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α等)调节T细胞的分化，诱导免疫应答促进炎症反应；Th2以调节体液免疫为主，主要通过分泌Th2细胞因子(IL-4、IL-6和IL-10等)抑制母体免疫应答，避免组织损伤过度[46].有研究[6,47]认为在正常的妊娠周期中，Th1细胞因子在母体中表达水平较低，而Th2细胞因子具有主导地位，Th2型细胞因子可通过抑制胚胎介导的母体免疫应答，进而维持正常的妊娠状态，TNF-α高水平表达不利于胚胎发育，IL-6高水平表达利于胚胎发育.但也有一些研究[9,46]认为IL-6高水平表达可刺激羊膜和蜕膜前列腺素过量产生，由此引发子宫收缩而破坏胚胎发育的正常环境.本研究发现自然流产患者比正常妊娠孕妇具有更高的血清TNF-α水平，而IL-6水平差异不显著，提示在自然流产患者体内Th1细胞因子具有主导地位，此过程可能会诱导免疫应答，促进炎症反应，不利于胚胎发育.此外，HCMV阳性自然流产患者比阴性自然流产患者具有更高的血清TNF-α水平，提示HCMV感染导致的自然流产与血清TNF-α水平上调相关.本研究中未得到自然流产与IL-6有相关性的证据，自然流产的发生与IL-6的相关性有待进一步研究.

在妊娠期间，IL-1正常表达可调节胎盘催乳素、绒毛膜促性腺激素、金属蛋白酶等物质的活性和含量，阻止子宫内膜基质细胞过度蜕膜化，利于胚胎植入和生长发育.然而当IL-1过量表达时，一方面可促使妊娠组织发生细胞凋亡，另一方面可通过基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)信号途径导致胎膜破裂，不利于妊娠[53-54].本研究显示自然流产患者比正常妊娠孕妇具有更高的血清IL-1水平，这可能与自然流产的发生有关，此外，HCMV阳性比阴性自然流产患者具有更高的血清IL-1水平，提示HCMV感染导致的自然流产与血清IL-1水平上调相关.

本研究的局限性：第一，本研究所纳入文献采用了DNA或IgM阳性作为HCMV感染的判断依据，不能反应活动性感染情况，活动性感染是否会更容易导致自然流产有待进一步研究.第二，有关细胞因子的研究之间存在显著的异质性，不同的纳入和排除标准、种族和检测试剂可能是导致异质性的原因，不同研究之间异质性的确切原因尚不清楚.第三，本研究未得到TNF-α和IL-1提示自然流产发生的危机值，以及未得出HCMV感染是如何上调血清TNF-α和IL-1水平，需要更多研究予以探究.

4 结 论

本研究表明HCMV感染会增加自然流产发生几率，该病毒感染所致自然流产可能与血清TNF-α和IL-1水平上调相关.

1) Meta分析结果显示，自然流产患者比正常妊娠孕妇有更高的HCMV阳性率(OR6.97,95%CI4.66～10.42,P<0.000 01).

2) 自然流产患者比正常妊娠孕妇具有更高的血清TNF-α水平(SMD2.69,95%CI2.36～3.82,P<0.000 01)和IL-1水平(SMD4.81,95%CI2.20～7.42,P=0.000 3)，然而IL-6水平(SMD0.37,95%CI-2.80～3.55,P=0.82)水平在两组间无显著差异.自然流产的发生可能与血清TNF-α和IL-1水平上调相关.

3) HCMV阳性比阴性自然流产患者具有更高的血清TNF-α水平(SMD1.45,95%CI0.88～2.02,P=0.000 4)、IL-1水平(SMD5.11,95%CI1.86～8.36,P<0.000 01)和IL-6水平(SMD4.28,95%CI1.01～7.55,P<0.000 01).HCMV感染可能通过上调血清TNF-α和IL-1水平促使自然流产发生.