格列齐特通过抑制mTOR信号通路对高糖诱导的足细胞损伤的保护作用

马常娥,于 沛,赵小云,肖红霞,陈维香

(1.河西学院附属张掖人民医院，2.河西学院医学院,甘肃 张掖 734000；3.上海市第六人民医院,上海 200233)

高糖诱导肾小球基底膜外侧的足细胞损伤，导致肾小球滤过功能受损，是引发糖尿病肾病的重要原因[1]。格列齐特是第二代磺脲类药物，对糖尿病肾病患者的肾功能具有保护作用[2]，但目前缺乏格列齐特在肾病细胞层面具体功能与机制的研究，因此本研究探讨格列齐特对高糖诱导的足细胞损伤的影响及机制，为阐明格列齐特对糖尿病肾病的保护作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器MPC5细胞购自美国ATCC细胞库；D-葡萄糖、格列齐特，均购自上海源叶生物科技有限公司；Hoechst 33258购自北京索莱宝科技有限公司；一抗抗体Bax、Bcl-2、Nephrin、podocin、p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K、p-4E-BP1、4E-BP1均购自美国Abcam公司；流式细胞仪，型号：BD FACSCalibur，购自美国BD公司。

1.2 细胞培养及分组MPC5细胞用含有10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素和10 kU·L-1的γ-干扰素的DMEM培养基培养，实验前用不含 γ-干扰素的培养基培养12 d诱导分化。实验设置对照组、高糖组、格列齐特组(5、10、20 μmol·L-1)。

1.3 MTT检测MPC5细胞存活率按“1.2”分组，培养24 h，加入100 μL MTT溶液，孵育4 h，弃上清后用二甲基亚砜重悬，酶标仪测定490 nm波长处的吸光度值，计算细胞存活率。

1.4 流式细胞术检测MPC5细胞凋亡率按“1.2”分组，培养24 h，胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤，加入结合缓冲液、Annexin V-FITC与PI，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测凋亡率。

1.5 Western blot检测MPC5细胞Bax、Bcl-2、Nephrin、podocin、mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表达按“1.2”分组，培养24 h，提取总蛋白，电泳、转膜、封闭，加一抗、二抗，曝光后用ImageJ分析条带。

1.6 Transwell检测MPC5细胞迁移水平按“1.2”分组，细胞在Transwell小室上室培养24 h，固定，结晶紫染色，显微镜下观察迁移细胞数。

Tab 1 Effect of gliclazide on proliferation,apoptosis and migration of MPC5 cells induced by high glucose n=9)

Tab 2 Effect of glicizide on protein levels of nephrin,podocin,p-mTOR /mTOR,p-P70S6K /P70S6K and p-4E-BP1/4E-BP1 of MPC5 cells induced by high glucose n=9)

2 结果

2.1 格列齐特对高糖诱导的MPC5细胞增殖、凋亡、迁移的影响与对照组比较，高糖组MPC5细胞存活率明显降低，凋亡率、Bax/Bcl-2蛋白水平、迁移数明显增加(P<0.01)，与高糖组比较，格列齐特组(5、10、20 μmol·L-1)MPC5细胞存活率明显增加，凋亡率、Bax/Bcl-2蛋白水平、迁移数明显降低(P<0.05)，见Tab 1。

2.2 格列齐特对高糖诱导的MPC5细胞Nephrin、podocin蛋白水平的影响与对照组比较，高糖组MPC5细胞Nephrin、podocin蛋白水平明显降低(P<0.01)，与高糖组比较，格列齐特组(5、10、20 μmol·L-1)MPC5细胞Nephrin、podocin蛋白水平明显增加(P<0.01)，见Tab 2。

2.3 格列齐特对高糖诱导的MPC5细胞mTOR信号通路相关蛋白表达水平的影响与对照组比较，高糖组MPC5细胞p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4E-BP1/4E-BP1蛋白水平明显增加(P<0.01)，与高糖组比较，格列齐特组(5、10、20 μmol·L-1)MPC5细胞p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4E-BP1/4E-BP1蛋白水平明显降低(P<0.01)，见Tab 2。

3 讨论

Bax、Bcl-2是调控细胞凋亡的重要蛋白，当Bax/Bcl-2比值增加时会诱导细胞凋亡[3]。Nephrin和podocin蛋白常用于衡量足细胞损伤[4]，本研究发现，格列齐特处理可明显提高高糖诱导的MPC5细胞存活率和Nephrin、podocin蛋白水平，降低凋亡率、迁移数和Bax/Bcl-2蛋白水平，表明格列齐特对高糖诱导的MPC5细胞损伤具有保护作用。

mTOR信号通路在高糖诱导的足细胞损伤及多种药理过程中发挥重要作用[5]。本研究发现，格列齐特明显降低高糖诱导的MPC5细胞mTOR、P70S6K、4E-BP1的磷酸化水平，推测格列齐特对高糖诱导的MPC5细胞的影响可能与其抑制mTOR信号通路有关。

综上所述，格列齐特可能通过抑制mTOR信号通路减轻高糖诱导的MPC5细胞损伤。