检测吡咯里西啶生物碱辅助诊断肝窦阻塞综合征

邵幼林 熊爱珍 张锁才 吴剑明 马春明 郭风彩 柳龙根

肝窦阻塞综合征(HSOS)也称作肝小静脉闭塞病，是由各种原因导致的肝血窦、肝小静脉和小叶间静脉内皮细胞水肿、坏死、脱落进而形成微血栓，引起肝内淤血、肝损伤和门静脉高压的一种病死率很高的肝脏血管性疾病，其原因之一是摄入含有肝毒性吡咯里西啶生物碱(HPA)的草药[1]。我国HPA相关HSOS (HPA-HSOS)主要是摄入菊三七根块成分引起[2]。由于部分患者不能准确提供服药史，更难正确提供服用草药药名，且包括蜂蜜、牛奶、肉、蛋和茶等众多动植物性食物中检测到HPA[3]，这些不确定性和隐蔽性为诊断和治疗HPA-HSOS造成了极大的困难。本研究试图通过检测患者摄入物中的HPA成分达到诊断HPA-HSOS的目的。

资料与方法

一、研究对象

选择2016年1月至2019年3月在常州市第三人民医院5例住院患者。根据患者病史，入院时临床特征、肝肾功能、凝血功能、血常规，结合彩超、增强CT或增强MRI影像学临床初步诊断为HSOS。排除布加综合征、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病和遗传代谢肝病。5例患者中1例服用物为菊三七叶，另外4例服用物的三七成分并不明确。故对5例患者服用物进行HPA成分检测。

二、实验方法

(一) 试剂与材料 色谱级乙腈购自Fisher公司，色谱级甲酸铵购自美国Sigma-Aldrich公司，色谱级氨水(25%)购自美国ROE SCIENTIFIC INC公司。分析纯甲酸、甲醇购自上海国药集团化学试剂有限公司。超纯水由Milli-Q纯水仪(Millipore, Bedford, MA, 美国)制备。千里光菲灵碱、千里光碱、千里光菲灵碱氮氧化物和千里光碱氮氧化物对照品购自成都普瑞法有限公司，纯度大于98%。 菊三七碱甲和菊三七碱甲氮氧化物由课题组前期从菊三七中分离纯化[4]，纯度均大于80%。

(二) 样品制备 药材烘干(60℃)或晾干(常温)后打粉，过40目筛，取0.2 g药材粉末，精密称定，加40 mL 0.5%的甲酸水溶液，称定重量，超声(100 Hz)40 min，放冷，再称定重量，用0.5%的甲酸水补足减失的重量，摇匀。静置，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤后0.5%甲酸水稀释10倍即得。精密吸取药酒1 mL，以0.5%甲酸水定容至50 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤即得。

(三) 仪器与分析条件 样本含量测定参考文献[5]，在Acquity Ultra Performance LCTM-Micromass ZQ 2000液质联用仪上进行，该仪器配备ESI离子源，单四级杆质谱检测器及MassLynx 4.1数据分析软件。色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)，柱温45 ℃，流动相10 mmol 甲酸铵水溶液(A)和乙腈(B)梯度洗脱，流速0.4 mL/min，进样量2 μL。样品槽温度10 ℃。质谱条件：毛细管电压3.5 kV，锥孔电压40 V，离子源温度150 ℃，去溶剂温度400℃，锥孔气流速50 L/h， 脱溶剂气流速900 L/h。

结 果

一、患者一般情况

患者入院后完善肝肾功能、凝血功能、血常规和彩超、增强CT或增强MRI检查。根据患者病史、入院后肝功能变化，采用RUCAM评分诊断药物性肝损伤，3例为很可能，2例为可能。结合影像学检查，临床诊断疑似HSOS 3例，2例诊断为酒精性肝病和慢加急性肝衰竭。5例患者一般情况和入院首次实验室检查结果见表1、2。

二、所服可疑物中HPA

对于菊三七叶的根、茎、叶，及其他服用物中千里光菲灵碱、千里光碱、菊三七碱甲及其N-氧化物等6种主要HPA的含量检测结果见表3。

表1 患者一般情况及转归

表2 患者入院首次主要检验结果

表3 患者摄入可疑物中HPA的含量

三、诊断、治疗和转归

基于HPA检测结果，4例患者诊断为HPA-HSOS，1例患者排除HSOS。确诊HSOS的4例患者在护肝、支持、利尿、维持能量和水电解质平衡治疗的基础上均接受抗凝治疗，最终2例存活，2例死亡。排除HPA-HSOS的1例患者避免抗凝治疗，在常规护肝支持、血浆置换等治疗下，病情持续进展，最终因肝衰竭行肝移植治疗。

讨 论

目前，在6000多种开花植物中已发现660个不同结构的含N-氧化物(PA)，其中在 C1 和 C2 之间具双键的 PA表现出强烈的肝毒性、基因毒性、肺毒性、神经毒性[3]。在菊三七中鉴定出21种肝毒性较强的PA结构，其中千里光碱 、千里光菲灵碱、菊三七碱甲及其N-氧化物含量最高[5]。大部分PA本身无直接毒性，经肝脏细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)代谢，导致其1、2-不饱双键断裂产生 PA 自由基[6]，PA自由基可能损伤肝细胞，且肝窦内皮细胞的损伤更严重，导致危及生命的HSOS。我国HPA-HSOS主要是服用菊三七所致[7]。本研究收集了1例HSOS患者服用的菊三七全株，并检测其干燥根、茎、叶中HPA成分，发现菊三七根、茎、叶中均含有HPA，HPA含量根>叶>茎。

目前诊断PA-HSOS主要依据病史、临床表现、实验室检查和影像学检查[7]。在我国，患者常将菊三七错误地用作三七的替代品，用以促进血液循环和消肿止痛，部分患者单纯的用其保健，多数患者将菊三七浸泡酒中长期饮用[8]。

PA-HSOS患者ALT、AST和ALP在2倍正常值上限以下，导致RUCAM量表评分较低；如患者提供的用药不准确，再次降低了评分，故采用RUCAM量表诊断HPA-HSOS存在缺陷。鉴于HSOS存在特异性的肝静脉显示不清、地图状、花斑样不均匀强化等影像学特征[7]，常通过典型病史结合影像学检查临床诊断HSOS。然而，布加综合征患者也存在类似改变，Kan等[9]报道布加综合征患者CT检查显示28.07%存在斑片状肝强化，19.30% 存在不均匀低衰减，因此病史模糊或摄入物难以辨认的患者临床诊断需慎重。

Gao等[10]研究显示，采用高效液相色谱-串联质谱法测定患者血清中吡咯蛋白加合物 (pyrrole-protein adducts, PPA)对PA-HSOS具有较高的灵敏度和特异性，血PPA浓度与停用相关药物时间、HSOS的严重程度及临床转归有关。Xia等[11]报道了在动物试验中可以采用PPA作为潜在的诊断标志物。在HSOS患者的血清和肝脏中也发现了PPA[12]。一组18例HSOS患者入院1个月后的血样中均检测到PPA，提示其可用作 PA 遗传毒性的诊断生物标志物[13]。但对停药时间很长就诊的患者体内是否可以检测到PPA不得而知，因此，使用PPA作为生物标志物仍需更深入研究。如能明确患者摄入物的成分亦有重要的参考价值。本研究发现2例服用三七粉和1例饮用三七酒中含有HPA，而1例影像学可疑HSOS患者服用的三七粉不含PA，排除PA-HSOS。

总之，服用菊三七叶与根块一样会导致典型的HSOS。对于能确切提供可辨识的食用药物及病史的患者，结合影像学检查一般临床诊断较为可靠。但对于病史不详细、摄入物难以辨认的患者，对其摄入物HPA检查，有利于提高对HSOS的诊断、合理治疗。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。