基于分子对接及实验验证研究补肾健脾活血方通过Wnt信号通路防治骨质疏松症的作用机制*

吴睿哲，吴 洁，刘 凯，葛殊玮，伍 强，曾景奇，王 凡

（湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

骨质疏松症（osteoporesis，OP）是一种以骨量丢失、骨小梁数量减少、骨密度降低导致全身骨骼强度降低为特征的原发性疾病，50岁以上女性的发病率为同龄男性的1.8倍，而绝经后女性的发病率更高。成骨-破骨平衡的改变是OP发病机制中备受关注的一种[1]，据此防治OP药物也主要分为骨吸收抑制剂和骨合成促进剂。随着细胞生物学的发展，激素、细胞因子、多肽等多种药物正逐步应用于防治OP[2]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的成骨、成脂分化及其功能的调控涉及多种蛋白及转录因子[3]，其中Wnt/β-catenin信号通路是促进BMSCs成骨分化不可或缺的重要信号通路。Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf related protein 1，DKK-1）及硬化蛋白（sclerostin，Sost）是Wnt通路的抑制性蛋白，通过与Wnt竞争性结合细胞膜表面的相应受体，影响下游因子β-catenin在细胞基质内的含量，最终影响通路下游靶基因的转录和表达。

中医学认为骨质疏松症的发生主要与肾虚、脾虚、血瘀3个因素有关，补肾健脾活血方正是针对“多虚多瘀”的病机特点所创立。近来，补肾活血类方剂防治骨质疏松症的研究取得了一定的成果[4]，课题组成员前期也已证实补肾健脾活血方可以促进成骨细胞骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）的表达。本研究通过网络药理学筛选方中核心成分，利用分子对接计算探究方中核心成分与DKK-1及Sost蛋白结合的可能性，并通过含药血清干预过表达质粒转染两种抑制性蛋白的MG63细胞，深入研究补肾健脾活血方防治骨质疏松症的具体分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 成分筛选与分子对接

1.1.1 补肾健脾活血方核心成分筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmsp-e.com/）及BATMAN数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中分别筛选补肾健脾活血方中10味中药的有效化学成分。根据ADME原则选取满足口服生物利用度（oral bioavailibility，OB）≥30%及类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的化学成分，通过Uniport数据库（https://www.uniprot.org/）进行成分靶点转化；在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中，以“Osteoporosis”为关键词搜索疾病靶点，并进行筛选，将上述靶点分别导入Cytoscape 3.8.2中构建“成分-靶点-疾病”网络，使用CytoNCA插件进行拓扑分析并筛选核心药物成分。

1.1.2 分子对接 选取方中核心成分与DKK-1以及Sost进行分子对接。在RCSB PDB数据库（https://www1.rcsb.org/）中下载DKK-1及Sost[5-6]的pdb格式结构文件；根据筛选结果在ZINC小分子数据库（https://zinc.docking.org/）中下载核心成分的mol2格式结构文件。运用AutoDockTools1.5.6对经筛选的核心成分与DKK-1及Sost进行分子对接，并用Pymol2.4.0对对接结果进行可视化呈现。

1.2 细胞实验

1.2.1 实验动物 健康成年SPF级雌性未孕SD大鼠16只，6个月龄，体质量（400±20）g，由湖南中医药大学动物实验中心统一购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，动物使用许可证号：SYXK（湘）2019-0009，在湖南中医药大学SPF级实验室中进行实验操作，饲养环境：温度（22±2）℃，湿度（65±5）%，光照/黑暗12 h交替，自由饮食，取材时将大鼠麻醉处死。实验经湖南中医药大学实验动物伦理委员会审核批准，批准编号：LL2020070601。实验过程中参照国家《关于善待动物的指导性意见》对大鼠进行处置，并按照4R原则给予人道关怀。

1.2.2 药物与试剂 补肾健脾活血方，方药组成：淫羊藿10 g，熟地黄10 g，肉苁蓉10 g，大枣10 g，当归10 g，菟丝子10 g，补骨脂10 g，黄芪10 g，白芍10 g，丹参10 g。上述中药均购置于湖南中医药大学第二附属医院，并由中药房煎制成水煮液。水煮液生药浓度为1.43g/mL。MEM培养基（批号：5811492）、MG63细胞（批号：5202470）购自上海中乔新舟生物科技有限公司；DKK-1过表达质粒（Ad-DKK-1）（批号：0025173）、Sost过表达质粒（Ad-Sost）（批号：0138194）均购自长沙艾碧维生物科技有限公司；LIP2000（批号：2398587）购自美国英杰生命技术有限公司；Wnt3a抗体（批号：AF01156173Q）购自北京博奥森生物技术有限公司；β-catenin抗体（批号：00018600）、βactin抗体（批号：10011066）均购自美国Proteintech公司；碱性磷酸酶（ALP）测试盒（批号：20210320）购自南京建成生物工程研究所。

1.2.3 主要仪器 YT-CJ-2NB型超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司）；SL02型低速离心机（上海知信实验仪器技术有限公司）；DH-160I型直热式二氧化碳培养箱（上海三腾仪器有限公司）；DSZ2000X型倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器仪表有限公司）；DYY-6C型电泳仪、DYCZ-24DN型电泳槽、DYCZ-40D型转膜仪（北京六一生物科技有限公司）；H1650R型台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2.4 动物分组及含药血清制备 大鼠按照体质量分层随机分为生理盐水组和补肾健脾活血方组，每组8只。补肾健脾活血方组大鼠灌胃给予补肾活血健脾方，4.8 g/kg，灌胃给药容量为10 mL/kg；生理盐水组大鼠灌胃给予等体积生理盐水。2次/d，灌胃间隔约5 h，连续灌胃7 d。最后一次灌胃2 h后予腹主动脉取血后人道主义处死各组大鼠，3 000 r/min离心15 min，取血清，灭活，过滤除菌，-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2.5 细胞培养及过表达质粒转染 MG63细胞培养于10%FBS+1%双抗的MEM专用培养基，2～3 d换一次液，细胞汇合率达80%左右，胰酶消化细胞，一分为二进行细胞传代，取对数生长的细胞接种在6孔板中待细胞贴壁，按以下分组进行如下处理。空载对照组：细胞转染过表达空载；过表达DKK-1组：细胞转染Ad-DKK-1过表达质粒；过表达Sost组：细胞转染Ad-Sost过表达质粒；过表达DKK-1+Sost组：细胞转染Ad-DKK-1和Ad-Sost过表达质粒。各组分别使用空白血清及含药血清干预。

1.2.6 ALP活性检测 血清干预细胞72 h后，收集提取总蛋白，BCA法定量检测蛋白浓度，按照ALP活性检测试剂盒操作说明检测细胞ALP活性。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞钙离子浓度 用无血清培养液稀释（1∶1 000）离子荧光探针，加入上述去除细胞培养液的细胞，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min后，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，经流式细胞仪检测细胞钙离子浓度。

1.2.8 Western blotting 检测通路蛋白Wnt3a、β-catenin表达 血清干预细胞72 h后，加入200 μL RIPA裂解液，超声破碎刮取的细胞悬液，BCA法定量检测蛋白浓度，并调整蛋白浓度至上样浓度，取20 μL样品上样进行电泳，电泳恒定电压75 V，时间130 min，转膜后PBST配制5%脱脂奶粉封闭液封闭，室温放置60 min，4 ℃过夜，次日室温放置30 min，按比例依次加入Wnt3a、β-catenin、β-actin一抗室温放置90 min孵育，洗涤，加入按比例稀释后的二抗与膜共同室温孵育90 min，暗盒内与X胶片曝光30 s，显影冲洗条带。

1.2.9 统计学方法 使用SPSS 23.0对实验数据进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”表示，两种血清干预组间采用独立样本t检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。使用GraphPad Prism 7.0进行数据可视化呈现。

2 结果

2.1 补肾健脾活血方核心成分筛选 在TCMSP数据库及BATMAN数据库中检索补肾健脾活血方成分，符合ADME原则进行二次筛选后，满足OB≥30%，DL≥0.18的主要成分共98种，通过Uniport数据库成分靶点转化。在GeneCards数据库中检索“Osteoporosis”，限定来源为“Homo sapiens”，通过中位数限制Relevance score＞1.013 324 261共获取1 107个相关疾病靶点，将补肾健脾活血方与OP靶点取交集共获得127个交集基因，将上述靶点分别导入Cytoscape 3.8.2中构建“中药-成分-靶点-疾病”网络，使用CytoNCA插件对网络进行拓扑分析，筛选出Dgree值排名前5的核心药物成分。（见表1）

表1 补肾健脾活血方核心成分信息表

2.2 分子对接结果及呈现 为进一步评价方剂中核心成分与DKK-1及Sost的亲和能力，使用AutodockTools对筛选出的有效成分及目标靶点进行分子对接计算，对接结果见表2。根据DENNIS G J等[7]研究报道，结合能≤-4.0 kcal/mol表明分子与靶点具有一定的结合活性，结合能≤-5.0 kcal/mol表明分子与靶点具有良好的结合活性，结合能≤-7.0 kcal/mol表明分子与靶点具有明显结合活性，故选用结合能≤-5.0 kcal/mol作为结合有效指标。结果显示，方剂核心成分与DKK-1结合能≤-5.0 kcal/mol的有效成分有5种；与Sost结合能≤-5.0 kcal/mol的核心成分有2种，采用Pymol2.4.0对核心成分与DKK-1及Sost对接结合能绝对值排名前3，且结合能≤-5.0 kcal/mol的结果进行可视化呈现，其中DC4进行可视化呈现时无法构建氢键，其余结果见图1。

表2 有效成分与DKK-1 及Sost 分子对接结果

图1 核心成分与靶点蛋白对接结果可视化呈现

2.3 各组MG63细胞ALP水平比较 经含药血清干预的空载对照组MG63细胞ALP水平与经空白血清干预的空载对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；经含药血清干预的过表达Sost组、过表达DKK-1组、过表达DKK-1+Sost组MG63细胞ALP水平均分别高于经空白血清干预的过表达Sost组、过表达DKK-1组、过表达DKK-1+Sost组（P＜0.01）。（见图2）

图2 各组MG63 细胞ALP 水平比较（）

2.4 各组MG63细胞钙离子浓度比较 经含药血清干预的空载对照组MG63细胞钙离子浓度明显低于经空白血清干预的空载对照组（P＜0.05）；经含药血清干预的过表达Sost组、过表达DKK-1组、过表达DKK-1+Sost组MG63细胞钙离子浓度均分别低于经空白血清干预的过表达Sost组、过表达DKK-1组、过表达DKK-1+Sost组（P＜0.01）。（见图3）

图3 各组MG63 细胞钙离子浓度比较（）

2.5 各组MG63细胞Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量比较 经含药血清干预的空载对照组、过表达Sost组、过表达DKK-1组、过表达DKK-1+Sost组MG63细胞β-catenin蛋白相对表达量均分别高于经空白血清干预的空载对照组、过表达Sost组、过表达DKK-1组、过表达DKK-1+Sost组（P＜0.01）；经含药血清干预的空载对照组、过表达Sost组、过表达DKK-1组MG63细胞Wnt3a蛋白相对表达量均分别高于经空白血清干预的空载对照组、过表达Sost组、过表达DKK-1组（P＜0.01）；经含药血清干预的过表达DKK-1+Sost组MG63细胞Wnt3a蛋白相对表达量与经空白血清干预的过表达DKK-1+Sost组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

成骨细胞与破骨细胞之间的“成骨-破骨”动态平衡变化一直是研究骨组织新生修复、维持骨量的关键，两种细胞分别来自BMSC以及造血干细胞的分化[8]。Wnt信号通路在2001年被证实与骨代谢关系密切，一方面可通过影响ALP、Runt相关转录因子2（Runx2）、骨钙素等多种蛋白和转录因子的表达调控BMSCs的成骨、成脂分化趋向[9-10]；另一方面Wnt信号通路可通过影响转录因子（T细胞因子/淋巴细胞增强因子）（TCF/LEF）的表达间接调控成骨细胞BMP-2的转录活性，同时调控BMSCs对BMP-2的结合活性，最终影响BMSCs的成骨分化[11-12]。破骨方面，经典的Wnt信号通路并未直接参与破骨细胞的分化和功能调控，而是通过促进成骨细胞中骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的表达调控破骨细胞的功能，影响骨吸收过程[13]。YAN D Y等[14]发现通过影响Wnt信号通路中间产物AKT/GSK3-β/β-catenin的调控轴不仅可以促进成骨细胞形成，还可以抑制破骨细胞的分化，而β-catenin的转录因子Catenin beta 1在绝经后骨质疏松症患者体内BMSCs中的表达低于健康患者[15]，因此调控β-catenin是骨重建的动态平衡中重要的一环。DKK-1和Sost均可通过与Wnt竞争性结合细胞表面的LRP5/6受体调控下游β-catenin的表达，但不同的是DKK-1与该受体结合时可与LRP5/6上各有的4个螺旋结构域同时作用，Sost只与LRP5/6上的第1个螺旋结构域作用。Wnt3a诱导BMSCs成骨分化实验显示，DKK-1对Wnt信号通路的抑制作用强于Sost[16]，故而抑制DKK-1的表达可能更有利于防治骨质疏松症。研究发现，体质量指数与骨密度存在正相关关系[17]，研究者认为机械性的应力刺激可增强骨重塑过程以对抗BMI的增加[18]。MORSE A等[19]通过构建胫骨压缩负荷小鼠模型观察骨重塑与骨量改变的研究发现，敲除DKK-1基因的小鼠骨体积和骨量均明显增加，而Sost的表达并没有随着DKK-1的缺失出现代偿性上升，相反出现了下降，表明机械负荷可以促进Wnt/β-catenin信号通路的表达，而DKK-1和Sost对骨量改变的作用可能是互相独立而不是互补的。研究发现DKK-1还可以激活非经典的Wnt信号通路及Smad信号通路促进成骨分化，而Sost在抑制Wnt信号通路的同时还可以通过影响OPG和RANKL的比例，增加破骨细胞数量并促进骨吸收[20-21]。

图4 各组MG63 细胞Wnt3a、β-catenin 蛋白相对表达量比较（）

分子对接计算显示，补肾健脾活血方中部分核心成分可以和DKK-1以及Sost进行对接，且与DKK-1的结合活性相对较好。其中谷甾醇（Sitosterol）与DKK-1结合能≤-7.0 kcal/mol，表明这一成分很可能是补肾健脾活血方与DKK-1作用的主要成分；而Sost的对接活性相对较差，并且与谷甾醇对接后无法进行氢键的构建，这可能与Sost通过短肽而非通过氢键与LRP6进行结合有关[22]。细胞实验中，与空白血清比较，经补肾健脾活血方含药血清干预的MG63细胞各项指标均呈有利表达。ALP水平与成骨细胞的分化和活性水平呈正相关，除空载对照组外，其余各组经含药血清干预的MG63细胞ALP水平均高于空白血清干预的细胞（P＜0.05）；细胞钙离子浓度的上升可导致钙超载及细胞凋亡的发生[23]，而细胞内钙离子浓度检测结果提示经含药血清干预的细胞钙离子浓度均明显下降。Western blotting结果提示过表达质粒转染后的细胞中Wnt3a及β-catenin蛋白明显下降，经含药血清干预后Wnt3a及β-catenin蛋白表达抑制效果明显改善。

补肾健脾活血方可能通过提高Wnt3a蛋白的表达量，抑制DKK-1及Sost对Wnt信号通路的抑制作用，影响成骨细胞中Wnt信号通路的表达，最终提高成骨细胞的活性及分化能力，从而防治OP。