肾安方对慢性肾脏病大鼠EGFR介导的PI3K/Akt通路的影响

宋 坚，王旭东，刘宏斌，曹兴建

（1.南通市第一人民医院，江苏 南通 226000；2.南京中医药大学，江苏 南京 210046）

肾纤维化是晚期肾病的常见病理特征，是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）进展为终末期肾衰竭（end stage renal disease，ESRD）最可靠的预测指标。肾安方是以脾肾双补，调和气血阴阳，泄浊通络为治法治疗慢性肾脏病的经验方。前期临床试验[1-2]已证实肾安方可以保护慢性肾脏病患者残余肾单位，减缓肾脏纤维化，延缓慢性肾脏病的进程。本实验旨以EGFR/PI3K/Akt为靶点，探讨肾安方干预CKD肾脏纤维化的机制作用，为肾安方的临床运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄健康雄性SPF级SD大鼠48只，体质量（200±20）g，由南通大学实验动物中心提供。生产许可证号：SCXK（苏）2019-0001。饲养于南通大学实验动物中心。动物实验室为清洁级，环境温度（21±3）℃，相对湿度60%～70%，12 h明暗循环；实验大鼠分笼饲养，自由饮水，进食标准普通饲料。动物伦理经南通大学医学实验动物管理委员会批准，动物伦理编号：S20200522-408。实验过程严格遵守动物福利与伦理原则。

1.2 药品与试剂 肾安方，方药组成：黄芪30 g，茯神20 g，炒白术15 g，六月雪30 g，生大黄10 g，川牛膝10 g，太子参15 g，猪苓20 g，泽泻15 g，车前子30 g，益母草20 g，南沙参15 g，丹参30 g，全瓜蒌15 g。黄芪（批号：211130）、茯神（批号：211215）、炒白术（批号：211116）、六月雪（批号：200201）、生大黄（批号：211012）、川牛膝（批号：210601）、太子参（批号：211110）、猪苓（批号：210514）、泽泻（批号：210101）、车前子（批号：210801）、益母草（批号：210817）、南沙参（批号：210901）、丹参（批号：210121）、全瓜蒌（批号：211129）均购自华润南通医药有限公司；腺嘌呤（批号：110886-200001）购自上海优选生物技术有限公司；羟苯磺酸钙胶囊（国药准字H20203548，规格：0.5 g/粒）购自江苏万高药业股份有业公司；肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白（24 h UTP）定量均委托南通市第一人民医院检验科检验；大鼠β2微球蛋白（β2-MG）ELISA试剂盒（批号：DS006）、大鼠甲状旁腺激素（PTH）ELISA试剂盒（批号：a12087）均购自上海优选生物科技有限公司；TNF-α ELISA试剂盒（批号：ERA56RB）、IL-6 ELISA试剂盒（批号BMS625）、TGF-β1 ELISA试剂盒（批号：BMS623-3）均购自Thermo Fisher Scientific公司；动物RNA提取试剂盒（批号：BTN71201）、RTqPCR试剂盒（批号：WE0139）均购自北京百奥莱博科技有限公司；兔源Anti-EGFR一抗（批号：AF6043）、兔源Anti-p-EGFR一抗（批号：AF3052）、兔源Anti-PI3K一抗（批号：AF6241）、兔源Anti-p-PI3K一抗（批号：AF3241）、兔源Anti-Akt一抗（批号：AF6261）、兔源Anti-p-Akt一抗（批号：AF0016）、Antiβ-actin一抗（批号AF7018）、HRP标记山羊抗鼠IgG二抗（批号：S0002）均购自美国Affinity公司。

1.3 主要仪器 Nano Drop 2000C型紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Allegra X-15R型离心机（美国Beckman Coulter公司）；RM2135型石蜡切片机（德国LEICA公司）；Shandon Pathcentre脱水机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CX31-32RFL光学显微镜（日本Olympus公司）；BMJ_B型病理组织包埋冷冻台（常州中威电子仪器厂）；Chemi Doc XRS型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；Stepone plus荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.4 造模与分组 48只SD大鼠适应性喂养1周后，逐个称体质量，按随机数字表法分为正常组12只，造模组36只。造模组大鼠按250 mg/（kg·d）剂量灌服腺嘌呤（腺嘌呤以生理盐水配成浓度为2.5%混悬液）；正常组大鼠每日给予等体积生理盐水（5 mL/只）灌胃，连续造模4周。在第29天，正常组随机取大鼠2只，造模组随机取大鼠6只，腹腔注射硫喷妥钠（200mg/kg）处死大鼠，取全血标本，检验BUN、Scr，取左肾制作病理切片。建模成功标准：（1）BUN、Scr较正常组明显升高；（2）光镜下见造模组大鼠肾组织纤维化，有炎症细胞浸润。

造模成功后，造模大鼠继续隔天灌胃给予250 mg/（kg·d）腺嘌呤混悬液以维持病程进展至第8周。在此期间将造模成功的30只大鼠按随机数字表法分为模型组、羟苯磺酸钙组、肾安方组，每组10只。

1.5 实验给药 按照体表面积换算，肾安方组大鼠给予肾安方灌胃，24.1 g/（kg·d）（相当于临床70 kg成年人等效剂量）；羟苯磺酸钙组大鼠给予羟苯磺酸钙灌胃，100 mg/（kg·d）；正常组和模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃。1次/d，连续给药4周。实验过程中，模型组大鼠死亡1只。

1.6 观察指标

1.6.1 生化指标 第8周末禁食不禁水24 h，代谢笼收集大鼠24 h尿液；腹腔注射硫喷妥钠（200 mg/kg）处死大鼠，取全血标本，室温静置2 h，5 000 r/min离心3 min，分离出血清。使用生化分析仪检测大鼠血清BUN、Scr、24 h UTP。β2-MG、PTH、TNF-α、IL-6、TGF-β1按试剂盒说明以ELISA法测定。

1.6.2 肾脏病理学观察 取各组大鼠左侧肾脏以4%多聚甲醛固定24 h，经脱水、组织用石蜡包埋，切成4 μm厚石蜡切片，分别行HE、Masson染色。

肾小管间质纤维化指数测定：在高倍镜（×200）下随机选取10个不重叠视野测定小管间质纤维化面积与同视野小管间质总面积的百分比，进行半定量评分。评分标准：无病变，计0分；≤25，计1分；26～50，计2分，＞50，计3分。每张切片取10个视野的平均积分，计算各组的平均值。

1.6.3 各组大鼠肾组织EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA表达水平比较 取剩余适量肾组织，采用Trizol法抽提总RNA，反转录为cDNA，PCR反应条件为：45 ℃10 min，95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃45 s，40个循环。采用实时荧光定量PCR得到EGFR、PI3K、Akt扩增曲线与熔解曲线，记录Ct值，以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6.4 各组大鼠肾组织EGFR、PI3K、Akt蛋白表达水平比较 取各组大鼠肾组织，加入RIPA裂解液提取蛋白，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF转膜，加入5%BSA封闭1.5 h，分别加入β-actin、EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt一抗（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，Tris-HCl缓冲液（TBST）洗膜重复3次，每次5 min；加入HRP标记二抗（1∶10 000），37 ℃孵育1 h，ECL试剂盒发光，凝胶成像系统成像，Image J软件计算灰度值，采用目的蛋白条带与内参蛋白条带光密度比值作为结果进行统计分析。

1.7 统计学方法 通过GraphPad Prism 9.2软件进行数据处理，计量资料以（）表示，方差齐时，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠生化指标比较

2.1.1 各组大鼠血清BUN、Scr含量比较 模型组大鼠血清BUN、Scr含量均明显高于正常组（P＜0.01）；肾安方组、羟苯磺酸钙组大鼠血清BUN、Scr含量均明显低于模型组（P＜0.05）；肾安方组大鼠血清BUN、Scr含量均明显低于羟苯磺酸钙组（P＜0.05）。（见图1）

图1 各组大鼠血清BUN、Scr 含量比较（）

2.1.2 各组大鼠血清PTH、β2-MG、24 h UTP水平比较 模型组大鼠血清PTH、β2-MG、24 h UTP水平均明显高于正常组（P＜0.01）；肾安方组、羟苯磺酸钙组大鼠血清PTH、β2-MG、24 h UTP水平均明显低于模型组（P＜0.05）；肾安方组大鼠血清PTH、β2-MG、24 h UTP水平均明显低于羟苯磺酸钙组（P＜0.05）。（见图2）

图2 各组大鼠血清PTH、β2-MG、24h UTP 水平比较（）

2.1.3 各组大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1含量比较 模型组大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1含量均明显高于正常组（P＜0.01）；肾安方组、羟苯磺酸钙组大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1含量均明显低于模型组（P＜0.05）；肾安方组大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1含量均明显低于羟苯磺酸钙组（P＜0.05）。（见图3）

图3 各组大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1 含量比较（）

2.2 各组大鼠肾组织病理学改变情况 正常组大鼠肾组织可见肾小球结构正常，肾小管结构清楚，肾间质无炎症细胞浸润，无纤维组织增生。模型组大鼠肾组织可见肾小球结构紊乱，系膜增生，肾小球周围纤维化；肾小管管腔扩张明显，肾小管纤维化，管径缩窄；肾间质水肿，可见大量炎症细胞浸润，部分肾间质纤维化。肾安方组大鼠肾组织可见肾小球病变程度较模型组明显减轻，有系膜增生，肾小球呈局灶节段性硬化，部分肾小管上皮细胞混浊肿胀，管径变小，部分肾小管扩张；肾间质水肿，有炎症细胞浸润。羟苯磺酸钙组大鼠肾组织可见肾小球结构清晰，有系膜增生，肾小球未见明显萎缩；肾小管管腔未见明显扩张，部分肾小管上皮细胞略肿胀，管径稍窄；肾间质轻度水肿，可见局灶性炎症细胞浸润。（见图4）

Masson染色结果显示：与正常组比较，模型组大鼠肾脏纤维化指数明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，肾安方组、羟苯磺酸钙组大鼠肾脏纤维化指数均明显降低（P＜0.05）；肾安方组大鼠肾脏纤维化指数明显低于羟苯磺酸钙组（P＜0.05）。（见图4～5）

图4 各组大鼠肾组织病理学改变情况（×200）

图5 各组大鼠肾脏纤维化指数比较（）

2.3 各组大鼠肾组织EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA表达水平比较 模型组大鼠肾组织EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相对表达量均明显高于正常组（P＜0.01）；肾安方组、羟苯磺酸钙组大鼠大鼠肾组织EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相对表达量均明显低于模型组（P＜0.05）；肾安方组大鼠肾组织EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相对表达量均明显低于羟苯磺酸钙组（P＜0.05）。（见图6）

图6 各组大鼠肾组织EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA 相对表达量比较（）

2.4 各组大鼠肾组织EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表达水平比较 模型组大鼠肾组织p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K均明显高于正常组（P＜0.01）；肾安方组、羟苯磺酸钙组大鼠肾组织p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K均明显低于模型组（P＜0.05）；肾安方组大鼠肾组织p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K均明显低于羟苯磺酸钙组（P＜0.05）。（见图7～8）

图7 各组大鼠肾组织EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K 蛋白相对表达量比较（）

图8 各组大鼠肾组织EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K 蛋白表达Western blotting 图

3 讨论

慢性肾脏病临床上常见水肿、恶心呕吐、乏力、食欲不振、小便不通等症状，在中医学中属于“水肿”“关格”“虚劳”“溺毒”等范畴。国医大师邹燕勤继承并发展其父邹云翔理论，认为慢性肾衰竭的病机为肾元衰竭，浊毒潴留[3]。由于肾元衰竭、浊毒潴留而致肾脏纤维化不断进展。南通市名中医王旭东在此理论基础上，结合三十余年的临床经验总结出脾肾双补、调节气血阴阳佐以泄浊的治疗大法，并拟定肾安方。方中取大黄通利肠腑，使邪毒从肠道而走；以茯苓、猪苓、车前子、泽泻利水渗湿，使邪毒从小便排解而出；佐以黄芪健脾行气、利水消肿，六月雪、益母草、丹参、川牛膝等活血化瘀、利水消肿；太子参、南沙参清热养阴，利水而不伤阴；全瓜蒌清热润燥滑肠。诸药相合以达益气健脾、固本培肾、调和气血阴阳、泄浊解毒之功。

现代药理学研究显示，大黄中的有效成分包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚[4]。其中大黄素可以通过调节HIF-1α/VEGF/PDGFR-α信号转导途径，逆转肾小管上皮间质转化，抑制细胞凋亡以抗肾脏纤维化[5]。黄芪的有效成分包括黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪类黄酮等[6]。黄芪多糖可通过抑制TGF-β1/ILK途径来抑制炎症反应和纤维化进程，从而保护肾功能[7]。丹参的主要有效成分丹参酮含有超过50种化合物，如丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和丹参酮ⅡB，以及水溶性化合物丹酚酸A、丹酚酸B和丹参醇等[8]。丹参酮ⅡA和丹酚酸可以激活Akt/GSK-3β/Nrf2信号通路，上调BMP-7和Smad6，抑制NF-κB/p38/MAPK和TGF-β/Smad信号通路，从而减轻氧化应激和炎症[9-10]；丹酚酸B可以通过HPSE/SDC1轴减轻肾损伤[11]。

羟苯磺酸钙为微血管保护药物，是较为公认的能直接用于预防和治疗微血管循环障碍的药物，能够抗炎、抗氧化、改善内皮功能紊乱、抑制纤维组织和新生血管增生，并可以通过减少足细胞融合来减轻蛋白尿，从而保护肾脏，因此本实验以羟苯磺酸钙为阳性对照药物[12-13]。

表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGFR），是一种多功能的信号转导子，在细胞增殖、存活、分化、迁移、炎症等细胞过程和基质内稳态中发挥重要作用[14]。EGFR可能通过激活多种信号通路，特别是PI3K/Akt/mTOR信号通路介导器官纤维化，尤其是肾脏纤维化[15-16]。过量的EGFR通过增加TGF-β1的表达，调节TGF-β信号的激活，诱导肾纤维化，促进上皮细胞G2/M阻滞，并增强炎症细胞因子或化学激酶的产生[17-19]。PI3K/Akt信号通路是一条经典的信号传导途径，它们参与了细胞的存活与凋亡、增殖与分化等多种生理病理过程。研究证明，在缺氧诱导的肾脏纤维化实验中，PI3K/Akt通路激活与肾脏纤维化进程密切相关，抑制PI3K活化可减少细胞外基质（ECM）的积累，而抑制Akt则可降低梗阻性肾病的肌成纤维细胞标志物[17,20]。本实验结果显示腺嘌呤所致的慢性肾脏病模型大鼠肾脏纤维化与EGFR激活的PI3K/Akt信号通路过度活化相关。本实验结果显示羟苯磺酸钙与肾安方均可抑制EGFR磷酸化，从而抑制PI3K/Akt通路的激活，减少TGF-β1的含量；且肾安方较羟苯磺酸钙的作用更为明显。

炎症细胞是纤维化微环境的重要组成部分。肾脏损伤后持续存在的炎症促进了纤维化的发生发展；如巨噬细胞激活M1型在损伤早期释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子，导致组织损伤和肾脏纤维化的发生；随着肾脏损伤加重，巨噬细胞转化为M2型，通过产生并分泌TGF-β1、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）等细胞因子促进成纤维细胞活化及ECM产生[21]。其中TGF-β1是肾纤维化的关键因子，可以诱导系膜细胞的增殖，促进肌成纤维细胞活化，导致多种ECM成分沉积于肾小球，减少ECM的降解，导致肾脏进行性纤维化改变[22-23]。因此，抑制炎症因子活性能缓解肾脏纤维化进程。本研究结果显示，羟苯磺酸钙和肾安方均能减轻慢性肾脏病大鼠炎症反应，二者相比，肾安方具有更明确的疗效。

由此可见，肾安方能够减轻慢性肾脏病大鼠的肾脏纤维化进程，可能与以下几种原因有关：（1）通过肠道排毒减少血液中的各种毒素，包括尿素氮、肌酐、甲状旁腺激素等；（2）减少尿蛋白排泄，维持血液蛋白含量，提高机体免疫力；（3）减轻血管微炎症反应，抑制炎症因子释放，减少进一步的免疫反应；（4）抑制EGFR磷酸化，从而抑制PI3K/Akt通路的激活，减少TGF-β1的含量。

综上，肾安方可以减少慢性肾脏病大鼠血液中各种毒素，减少蛋白尿，减轻肾脏炎症反应，保护肾脏；其延缓肾脏纤维化进程可能与抑制EGFR磷酸化，抑制PI3K/Akt通路的激活有关。